Méthode d’essai biologique : essai de létalité aiguë sur les espèces de daphnies

Série de la protection de l'environnement

Section de l’élaboration des méthodes et des applications
Centre de technologie environnementale
Environnement Canada

Rapport SPE 1/RM/11

Juillet 1990
(avec les modifications de mai 1996)

(Version PDF - 512 Ko)

Table des matières

Commentaires

Les personnes qui désirent faire part de leurs commentaires sur la teneur du présent rapport sont priées de les adresser à :

Richard Scroggins
Section de l’élabloration des méthodes et des applications
Centre de technologie environnementale
Environnement Canada
335 River Road
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3

Résumé

Le présent document expose les méthodes recommandées par Environnement Canada pour l’exécution d’essais de létalité aiguë sur des daphnies (Daphnia magna, D. pulexou l’une et l’autre espèces).

Il présente les conditions et méthodes générales ou universelles permettant de réaliser des essais de létalité aiguë sur un large éventail de substances.  Il précise d’autres conditions et méthodes propres à l’évaluation d’échantillons de produits chimiques, d’effluents, d’élutriats, de lixiviats ou de milieux récepteurs.  Le lecteur y trouvera des instructions sur les conditions et les règles d’élevage des daphnies, la manipulation et le stockage des échantillons, les installations d’essai requises, les méthodes de préparation des solutions d’essai et de mise en route des essai, les conditions prescrites pour les essais, les observations et mesures appropriées, les résultats des essais, les méthodes de calcul et l’utilisation de produits toxiques de référence.

Avant-propos

Le présent document fait partie d'une série de méthodes recommandées pour mesurer et évaluer les effets bioaquatiques de substances toxiques. Ces méthodes on été évaluées par la Direction de la protection de l’environnement (DPE); elles sont recommandées pour les applications suivantes :

  • utilisation dans les laboratoires de toxicité aquatique d’Environnment Canada et des provinces;
  • essais confiés en sous-traitance par Environnement Canada ou demandés à des organismes ou à des entreprises de l'extérieur;
  • remplacement d'instructions plus précises, par exemple celles prévues dans des règlements; et
  • fondement pour l'établissement d'instructions très explicites devant figurer, en certaines circonstances, dans un protocole juridique ou une méthode de référence normalisée.

Les différents types d'essais compris dans cette série ont été choisis parce qu'ils sont acceptables aux fins des programmes de protection et de conservation environnementales d'Environnement Canada. Ces documents visent à fournir des lignes directrices et à faciliter l'utilisation de méthodes cohérentes, pertinentes et exhaustives pour recueillir des données sur les effets toxiques d'échantillons de produits chimiques, d'effluents, d'élutriats, de lixiviats et de milieux récepteurs.

Dans le présent document, la mention d'appellations commerciales ne constitue nullement une recommandation de la part d'Environnement Canada; d'autres produits de valeur semblable peuvent être utilisés.

Liste des abréviations

BPC
biphényles polychlorés
°C
degré Celsius
CaCO3
carbonate de calcium
CaSO4
sulfate de calcium
CE50
concentration efficace 50
CL50
concentration létale 50
d
jour
EIT
Évaluation d'identification de la toxicité
g
gramme
h
heure
HCl
acide chlorhydrique
H2O
eau
KCl
chlorure de potassium
L
litre
MC
marque de commerce
mg
milligramme
MgSO4
sulfate de magnésium
min
minute
mL
millilitre
mm
millimètre
N
normal
NaHCO3
bicarbonate de sodium
NaOH
hydroxyde de sodium
OD
oxygène dissous (concentration)
SI
Système international d'unités
TL50
temps létal 50
YCT
moulée de levure, de Cerophyll MC et de truite (Yeast Cerophyll MC, Trout)
μ
micro
>
supérieur à
<
inférieur à
supérieur ou égal à
inférieur ou égal à

Glossaire

Remarque : Toutes les définitions ci-après s'appliquent aux méthodes énoncées dans le présent rapport; il se peut qu'elles ne soient pas adaptées à d'autres contextes.

Verbes auxiliaires

L'auxiliaire doit (doivent) est utilisé pour exprimer une obligation absolue.

L'auxiliaire devrait (devraient) et le mode conditionnel (il faudrait, etc.) sont utilisés pour indiquer que la condition ou la méthode en cause est recommandée et doit être respectée dans la mesure du possible.

L'auxiliaire peut (peuvent) indique qu'on est autorisé à faire une chose ou en mesure de la faire.

Termes techniques généraux

Acclimatation
Adaptation physiologique à un niveau précis d'une ou de plusieurs variables environnementales, par exemple la température. Ce terme s'applique généralement à des conditions contrôlées en laboratoire.
Conductivité
Expression numérique de la capacité d'une solution aqueuse de transporter un courant électrique. Cette capacité dépend des concentrations des ions en solution, de leur valence et de leur mobilité, ainsi que de la température de la solution. La conductivité s'exprime normalement en milli siemens par mètre (unité SI), ou en μmho/cm (1 mS/m = 10 μmhos/cm).
Conformité
Fait de respecter les exigences du gouvernement en matière de réglementation ou de délivrance de permis.
Daphnie
Invertébré micro crustacé d'eau douce, communément appelé puce d'eau. Daphnia magna et D. pulex sont deux espèces de daphnies.
Dispersant
Substance chimique qui réduit la tension superficielle entre l'eau et une substance hydrophobe (p. ex., du pétrole), ce qui facilite la dispersion de cette substance dans l'eau sous forme d'émulsion.
Dureté
Concentration, dans l'eau, de cations réagissant avec une solution savonneuse de sodium pour entraîner la précipitation d'un résidu insoluble. En règle générale, la dureté correspond à la concentration d'ions de calcium et de magnésium dans l'eau et s'exprime en mg/L de carbonate de calcium ou l'équivalent.
Élevage
Ensemble des animaux qu'on élève dans des conditions contrôlées afin d'obtenir, par reproduction, des organismes devant être soumis à des essais.
Émulsifiant
Substance chimique qui facilite le mélange fin (sous forme de minuscules gouttelettes), dans l'eau, d'une substance normalement hydrophobe.
Floculation
Formation d'un précipité léger en suspension (floc) dans une solution.
Lux
Unité SI d'éclairement, mesurant l'intensité lumineuse par mètre carré. 1 lux = 0,0929 piedbougie; 1 pied-bougie = 10,76 lux.
Néonate
Individu né ou éclos depuis peu (daphnie au premier stade larvaire, âgée de 24 h ou moins).
pH
Logarithme négatif de l'activité des ions d'hydrogène, mesurée par leur concentration en équivalents grammes par litre. Cette valeur exprime le degré ou l'intensité des réactions acides et alcalines selon une échelle de 0 à 14, où le nombre 7 représente la neutralité et les nombres inférieurs correspondent, en ordre décroissant, à des réactions acides de plus en plus fortes; les chiffres supérieurs à 7 indiquent, en ordre croissant, des réactions basiques ou alcalines de plus en plus fortes.
Photopériode
Durée d'éclairement et d'obscurité au cours d'un cycle de 24 h.
Pourcentage (%)
Concentration exprimée en parties par centaine. Un pour cent représente une unité ou partie de matière (p. ex., effluent, élutriat, lixiviat ou milieu récepteur) diluée dans l'eau, jusqu'à concurrence de 100 parties. On peut préparer des concentrations en masse par unité de masse ou en volume par unité de volume; on les exprime en pourcentage de la matière en cause dans la solution définitive.
Précipitation
Formation d'un solide (précipité) à partir d'une solution.
Prétraitement
Dans le présent rapport, traitement d'un échantillon ou de sa dilution avant l'exposition des daphnies.
Salinité
Quantité totale, en grammes, de solides dissous dans 1 kg d'eau de mer. Elle se détermine après conversion de tous les carbonates en oxydes, après remplacement de tous les bromures et iodures par des chlorures et après oxydation de toutes les matières organiques. La salinité peut aussi se mesurer directement grâce à un salinimètre/conductimètre ou par d'autres moyens (APHA et al., 1989). Elle s'exprime habituellement en parties par millier (‰).
Surfactant
Substance chimique active en surface (p. ex., un détergent) qui, ajoutée à un liquide non aqueux, en diminue la tension superficielle et facilite la dispersion des matières dans l'eau.
Surveillance
Activités de vérification de la qualité ou de collecte et de communication de données, effectuées de façon régulière (p. ex., quotidienne, hebdomadaire, mensuelle ou trimensuelle). Dans le contexte du présent rapport, ce terme s'applique à la vérification et à la mesure périodiques (régulières) de certaines variables biologiques ou de la qualité de l'eau, ainsi qu'au prélèvement et à l'essai d'échantillons d'effluents, d'élutriats, de lixiviats ou de milieux récepteurs pour la mesure de leur toxicité.
Turbidité
Degré de réduction de la clarté de l'eau par la présence de matières en suspension ou autres qui entraînent la diffusion et l'absorption de la lumière, plutôt que sa transmission en ligne droite dans l'échantillon. La turbidité s'exprime généralement en unités de turbidité néphélométrique.

Termes désignant les substances d’essais

Contrôle
Traitement reproduisant l'ensemble des conditions et facteurs qui pourraient influencer les résultats d'une enquête ou d'une étude, à l'exception de la condition particulière faisant l'objet de cette étude. Dans un essai de toxicité aquatique, le contrôle doit reproduire toutes les conditions du ou des traitements d'exposition, mais ne pas renfermer la substance à expérimenter. Le contrôle est utilisé pour établir l'absence de toxicité mesurable en raison de conditions de base de l'essai (p. ex., qualité de l'eau de contrôle/de dilution, état de santé ou la manipulation des organismes soumis à l'essai).
Eau d'amont
Eau de surface (p. ex., d'un ruisseau, d'une rivière ou d'un lac) qui n'est pas soumise à l'influence de la substance à expérimenter, du fait qu'elle se trouve contre le courant ou assez loin perpendiculairement à celui-ci.
Eau de contrôle/de dilution
Eau utilisée pour le contrôle, pour diluer la substance à expérimenter ou à l'une et l'autre de ces fins.
Eau de dilution
Eau utilisée pour diluer la substance à expérimenter afin d'en préparer différentes concentrations pour les divers traitements des essais de toxicité.
Eau déchlorée
Eau chlorée (généralement, eau potable municipale) qu'on a traitée afin d'en éliminer le chlore et ses composés en solution.
Eau désionisée
Eau qu’on a fait passer à travers des colonnes de résine afin d'en extraire les ions et de la purifier.
Eau distillée
Eau qu’on a fait passer a travers un appareil de distillation (au verre borosilicaté ou autre) afin d'en éliminer les impuretés.
Eau reconstituée
Eau désionisée ou distillée au verre à laquelle des produits chimiques réactifs ont été ajoutés. L'eau douce synthétique qui en résulte est exempte de contaminants et possède le pH et la dureté souhaités.
Eau usées
Terme général englobant les effluents, les lixiviats et les élutriats.
Effluent
Tout déchet liquide (industriel ou urbain) rejeté dans l'environnement aquatique.
Élutriat
Solution aqueuse obtenue après avoir ajouté de l'eau à un déchet solide (p. ex., stériles ou boues de forage ou de dragage), avoir agité le mélange, puis l'avoir centrifugé ou filtré ou avoir décanté le surnageant.
Lixiviat
Eau ou eau usée ayant traversé une colonne de sols ou de déchets solides dans l'environnement.
Milieu récepteur
Eau de surface (p. ex., dans un cours d'eau) où des déchets ont été ou sont sur le point d’être déversés (p. ex., immédiatement en amont du point de rejet). D'autres termes doivent être employés afin de préciser le sens de ce terme dans son contexte.
Produit chimique
Dans le présent rapport, se dit de tout élément, composé, formule ou mélange de substances chimiques qui peut se retrouver dans l'environnement aquatique par déversement, application ou rejet. Les insecticides, les herbicides, les fongicides, les larvicides employés contre la lamproie marine et les agents de traitement des déversements de pétrole sont des exemples des produits chimiques qui se retrouvent dans l'environnement.
Produit toxique de référence
Produit chimique étalon utilisé pour mesurer la sensibilité des organismes soumis à l'essai afin d'établir les limites de confiance des données de toxicité recueillies sur une substance à expérimenter. Dans la plupart des cas, on exécute un essai de toxicité sur un produit toxique de référence afin d'évaluer la sensibilité des organismes au moment de l'étude d'une substance à expérimenter, ainsi que la précision des résultats obtenus par le laboratoire.

Termes de toxicologie

CE50
Concentration efficace 50, soit la concentration que est censée causer un effet particulier, létal ou non létal, pour 50 % des organismes soumis à l'essai. L'effet particulier doit être précisé. ainsi que la durée d'exposition (p. ex., CE50 d'inhibition de la mobilité après 48 h).
CL50
Concentration létale 50, soit la concentration dans l'eau d'une substance qui est censée être létale pour 50 % des organismes soumis à l'essai. La CL50 et ses limites de confiance à 95 % s'obtiennent généralement par analyse statistique des mortalités dans plusieurs concentrations d'essai, après une durée fixe d'exposition. La durée d'exposition doit être précisée (p. ex., CL50 après 96 h).
Essai à renouvellement continu
Essai de toxicité pendant lequel les solutions des réservoirs d'essai sont renouvelées en continu par l'apport constant d'une solution fraîche ou par un apport intermittent fréquent.
Essai à renouvellement périodique
Essai de toxicité pendant lequel les solutions d'essai sont renouvelées périodiquement, généralement aux 24 heures. Syn. Renouvellement, semi-statique, à renouvellement séquentiel.
Essai de toxicité
Détermination de l'effet d'une substance sur un groupe d'organismes sélectionnés, dans des conditions définies. Un essai de toxicité aquatique permet généralement de mesurer dans quelle proportion des organismes sont affectés par une exposition à des concentrations particulières de produits chimiques, d'effluents, d'élutriats, de lixiviats ou de milieux récepteurs.
Essai statique
Essai de toxicité pendant lequel les solutions d'essai ne sont pas renouvelées.
Évaluation d'identification de la toxicité
Prétraitement systématique d'un échantillon (p. ex., correction du pH, filtration, aération), suivi d'essais de toxicité aigüe. Cette évaluation permet de définir le ou les agents causals qui sont les principaux responsables de la toxicité aiguë dans un mélange complexe.
Évident
Clairement discernable dans les conditions d'essai utilisées.
Immobilité
Inaptitude à la nage pendant les 15 secondes suivant une légère agitation de la solution d'essai, même se les daphnies peuvent encore bouger leurs antennes.
Létal
Qui entraîne la mort par action directe. Dans le cas de la daphnie, on entend par «mort» la cessation de tous les signes visibles de mouvement ou d'activité, notamment en ce qui concerne les antennes, les pattes abdominales, et le battement cardiaque, observés au microscope.
Résultat
Variable (p. ex., le délai, la réaction des organismes soumis à l'essai) indiquant la fin d'un essai; mesure ou valeur dérivée caractérisant l'effet de la substance à expérimenter (CL50, TL50, etc.).
Sublétal
Nocif pour les organismes, mais en deçà du niveau qui entraîne directement la mort pendant la durée de l'essai.
TL50
Temps létal 50, soit la durée d'exposition qui est censée entraîner 50 % de mortalité au sein d'un groupe d'organismes détenus dans une solution d'essai particulière. Cette valeur s'estime le mieux par un représentation graphique.
Toxicité
Capacité propre d'une substance de provoquer des effets nocifs chez des organismes vivants.
Toxicité aiguë
Effet nocif discernable (létal ou sublétal) provoqué chez les organismes soumis à l'essai dans une courte période d'exposition courte à une substance à expérimenter, soit généralement 48 h ou moins dans le cas des daphnies.

Remerciements

Le présent document a été rédigé en collaboration par M. Don McLeay (McLeay Associates Ltd., West Vancouver, C.-B.) et M. John Sprague (J.B. Sprague Associates Ltd., Guelph, Ontario).

M. G. Sergy et M. R. Scroggins (Protection de l'environnement (PE), Environnement Canada) ont fait fonction de responsables scientifiques officiels et ont apporté leur collaboration et leurs conseils techniques pendant la durée des travaux.

Les membres du Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique (GITA) (annexe A) ont participé activement à l'élaboration et à l'examen du document et méritent tous nos remerciements. Nous tenons à souligner en particulier l'apport technique des membres du sous-comité du Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique (composé de K Doe, D. MacGregor, R. Parker, R. Scroggins, G. Sergy, R. Watts et G. Westlake) qui a assumé la responsabilité de la première et de la dernière révisions. Nous tenons également à remercier l'équipe des laboratories d'essai d'Environnement Canada (annexe A).

Les personnes suivantes, qui ont en passé en revue la version définitive, ont apporté des observations et des conseils à la fois nombreux et utiles : S. Wade (PE, Dartmouth, N.-É.), B. Dutka (NWRI, Burlington, Ont.), D. Moul (PE, North Vancouver, C.-B.), S. Yee (PE, North Vancouver, C.-B.), J. Vandermeulen ( ministère des Pêches et Océans (MPO), Dartmouth, N.-É.), B. Hobden (MPO, Winnipeg, Man.), J. Servizi (MPO, Cultus Lake, C.-B.), G. Joubert (ministère de l’Environnement du Québec, Sainte-Foy, Québec), D. Poirier (ministère de l’Environnement de l'Ontario, Rexdale, Ont.), S. Horvath (ministère de l’Environnement de la Colombie-Britannique, Vancouver C.-B.), J. Greene (Environmnental Protection Agency, Corvallis, OR), T. Kovacs (Institut canadien de recherches sur les pâtes et papiers (ICRPP), Pointe-Claire, Québec), S. Gibbons (ICRPP, Pointe-Claire, Québec), G. Craig (Beak Consultants Ltd., Brampton, Ont.), R. Evers (BAR Environmental, Guelph, Ont.), P. Chapman (EVS Consultants Ltd., North Vancouver, C.-B.), D. Monteith (B.C. Research Corp., Vancouver, C.-B.), et B. Tepper (U.S. Testing Co. Inc., Hoboken, NJ).

Section 1 : Introduction

1.1 Contexte

On ne peut s'attendre à ce qu'un seul organisme ou une seule méthode d'essai répondent aux besoins d'une démarche globale en matière de conservation et de protection de l'environnement. Pour mettre en oeuvre les mesures préventives et correctives nécessaires afin de gérer l'environnement, il faut pouvoir faire appel à une batterie d'essais de toxicité aquatique bien définis et triés sur le volet. Sergy (1987), en collaboration avec le Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique (consulter la liste des membres à l'annexe A), a proposé une série d'essais qui seraient généralement acceptables et qui permettraient de mesurer différents types d'effets toxiques chez divers organismes. L'essai de létalité aigüe sur les daphnies est l'un des essais de toxicité aquatique «de base» qu'on a choisi de normaliser de sorte qu'il permette de respecter les exigences d'Environnement Canada en matières d'essais.

Le présent rapport décrit les méthodes universelles qui s'appliquent à tout essai de létalité aiguë ou d'inhibition de la mobilité chez Daphnia magna ou D. pulexexécuté dans des conditions contrôlées en laboratoire. Il présente également des ensembles particuliers de conditions et de méthodes, prescrits ou recommandés lorsqu'on utilise des essais de létalité aiguë pour l'évaluation de différents types de substances (à savoir des échantillons de produits chimiques, d'effluents, d'élutriats, de lixiviats ou de milieux récepteurs) (figure 1). Les méthodes et conditions particulières applicables à la conduite de l'essai et à sa normalisation sont définies et, au besoin, analysées dans des notes en bas de page. En mettant au point ces méthodes, on s'est efforcé de mettre en balance des considérations scientifiques, pratiques et financières, en plus de veiller à ce que les résultats soient assez exacts et précis pour la majorité des cas d'application des méthodes.

Les auteurs ont supposé que le lecteur connaît déjà, dans une certaine mesure, les essais de toxicité aquatique. Le présent document ne renferme pas d'instructions explicites sur tous les détails, comme celles qui peuvent s'avérer nécessaires dans un protocole réglementaire particulier; néanmoins, il est destiné à servir de document directeur pour cette application et d'autres utilisations.

1.2 Répartition de l’espèce et utilisation antérieure pour des essais

Les daphnies sont des micro crustacés d'eau douce, généralement connus sous le nom «puce d'eau», qui appartiennent à l'ordre (ou sous-ordre) des cladocères. D. pulexatteint une longueur maximale d'environ 3,5 mm, alors que D. magna atteint de 5 à 6 mm. Ces espèces invertébrées constituent un élément important du zooplancton d'eau douce dans le monde entier (Herbert, 1979) et peuvent être les herbivores dominants dans les lacs. D. magna habite les lacs et les étangs; on la retrouve dans les eaux du nord et de l'ouest de l'Amérique du Nord dont la dureté atteint des valeurs supérieures à 150 mg/L (Pennak, 1978; Greene et al., 1988). Moins grosse, D. pulex habite essentiellement les étangs, les sections calmes des cours d'eau et, dans une moindre mesure, les lacs des quatre coins de l'Amérique du Nord, à des endroits où l'eau peut être douce ou très dure (EPA, 1985a).

Les daphnies constituent un bon choix pour l'exécution courante d'essais de toxicité dans les laboratoires du Canada, pour un certain nombre de raisons :

  • Au Canada, on les retrouve un peu partout dans les nappes d'eau douce et dans un large éventail d'habitats.
  • Elles constituent un lien important dans de nombreuses chaînes alimentaires aquatiques et représentent une source appréciable de nourriture pour les juvéniles des salmonidés et d'autres espèces de poissons.
  • Elles ont un cycle de vie relativement bref et sont assez faciles à élever en laboratoire.
  • Elles sont sensibles à un large éventail de contaminants aquatiques et sont très souvent utilisées dans des essais visant à évaluer la toxicité de produits chimiques et d'effluents.
  • En raison de leur petite taille, on n'a besoin que de faibles volumes d'eau pour les essais, ce facilité le prélèvement et le transport des échantillons d'eaux usées.
Figure 1 Schéma de la démarche adoptée pour définir les conditions et méthodes d'essai adaptées à différents types de substances

Méthodes universelles

  • Détention et acclimatation des organismes
  • Transfert des organismes
  • Préparation des solutions d'essai
  • Produits toxique de référence
  • Conditions de l'essai (pH, DO, etc.)
  • Mise en route de l'essai
  • Mesures de la qualité de l'eau
  • Observations pendant l'essai
  • Résultats de l'essai
  • Calculs
  • Validité des résultats
  • Considérations d'ordre juridique

Éléments traités dans les sections sur les méthodes particulières

Produits chimiques

  • Préparation des solutions
  • Choix de l'eau de contrôle/de dilution
  • Observations et mesures pendant l'essai
  • Résultats
  • Propriétés chimiques
  • Étiquetage et stockage
  • Mesures chimiques

Effluents, lixiviats et élutriats

  • Préparation des solutions
  • Choix de l'eau de contrôle/de dilution
  • Observations et mesures pendant l'essai
  • Résultats
  • Contenants et étiquetage
  • Transport et stockage des échantillons

Milieux récepteurs

  • Préparation des solutions
  • Choix de l'eau de contrôle/de dilution
  • Observations et mesures pendant l'essai
  • Résultats
  • Contenants et étiquetage
  • Transport et stockage des échantillons

À l'étranger, les daphnies (D. magna, D. pulex ou l'une et l'autre espèces) sont fréquemment utilisées, depuis quelques années, pour l'évaluation de la létalité aiguë de substances à expérimenter dans des conditions de laboratoire définies (Pays-Bas, 1980; OCDE, 1981; BHSC, 1982; ISO, 1982; AFNOR, 1984; Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique, 1986). Aux États-Unis, on a également mis au point des méthodes d'essai normalisées sur D. magnaou D. pulex pour connaître la toxicité aiguë d'échantillons d'effluents et de produits chimiques (EPA, 1982; Plotkin et Ram, 1983; ASTM, 1984; EPA, 1985a; 1985b; 1987; APHA et al., 1989) ou pour analyser la toxicité de sites de déchets dangereux (Greene et al., 1988). Au Canada, certaines provinces ont récemment ébauché ou publié des documents de méthodologie pour la réalisation d'essais de létalité aiguë sur des daphnies avec des échantillons d'effluents (Colombie-Britannique, 1988; Poirier et al., 1988; BNQ, 1990). Partout au Canada, les laboratoires d'Environnement canada (annexe A) disposent des compétences voulues pou l'exécution d'essais de létalité aiguë sur des daphnies, mais les méthodes utilisées diffèrent légèrement d'un établissement à un autre et aucune méthodologie «normalisée» n'a encore été élaborée ni adoptée (Sergy, 1987).

Les méthodes d'essai particulières exposées dans les documents de méthodologie existants sont suffisamment variées pour qu'on ne puisse garantir de résultats comparables pour différents essais portant sur des daphnies. En outre, ces documents passent sous silence de nombreuses questions de méthodologie (p. ex., celles concernent les influences modificatrices du pH ou de la dureté de l'eau d'essai); ils ne prévoient pas les mêmes résultats et limitent l'application des essais quant à leur contexte, à leur objet ou au type de substance à expérimenter. L'annexe Bdonne un aperçu des variables et des méthodes exposées dans les rapports de méthodologie actuels. Le présent document vise à définir une méthodologie canadienne «normalisée» pour l'exécution, au moyen de daphnies, d'essais de toxicité létale aiguë (ou d'inhibition aiguë de la mobilité) portant sur diverses substances à expérimenter.

Les questions dont nous venons de traiter ont été prises en considération dans l'élaboration du présent rapport. La méthodologie qu'il expose est conçue pour des daphnies acclimatées en eau douce et pour des solutions d'essai essentiellement constituées d'eau douce (c.-à-d. dont la salinité est inférieure ou égale à 10 ‰) ou constituées d'eau salée mais devant ensuite être rejetées dans des eaux douces; elle fait en outre appel à de l'eau douce comme eau de contrôle/de dilution. On peut l'utiliser dans d'autres contextes mais, dans certains cas, l'incidence réelle ou potentielle de substances données sur l'environnement d'eau douce est encore à l'étude. Il est possible d'utiliser d'autres essais, sur des espèces acclimatés à l'eau de mer, pour déterminer l'incidence réelle ou potentielle de substances dans les environnements estuariens ou marins, ou encore pour évaluer des solutions d'essai d'une salinité supérieure à 10 ‰ qui doivent être rejetées dans de tels environnements.

Section 2 : Organismes soumis à l'essai

2.1 Espèces

Il faut utiliser, dans un essai de toxicité donné, soit Daphnia magna, soit Daphnia pulex (figure 2).  Le choix de l'espèce dépend de la dureté de l'eau de contrôle/de dilution.  D. pulexpeut être utilisée dans tous les cas, mais il est recommandé d'y avoir recours si la dureté de l'eau de contrôle/de dilution est inférieure à 80 mg/L; on peut se servir de D. magnalorsque la dureté de l'eau est supérieure ou égale à cette valeurNote de bas de page 1.

2.2 Cycle biologique

On doit utiliser des daphnies néonates (âgées de 24 h ou moins) pour les essais. On les obtient en transférant des femelles gravides des réservoirs d'élevage à de plus petits contenants d'eau d'élevage/de contrôle/de dilution, 24 h avant le début de l'essai. Il est recommandé d'ajouter de la nourriture et, au besoin, des nutriments à cette eau (section 2.4.10) afin d'accroître la proportion d'adultes qui muent et libèrent leur couvée. Il est souhaitable, mais non nécessaire, de connaître l'âge des femelles et de les utiliser vers le milieu de leur période de reproduction (c.à-d., lorsqu'elles ont entre deux et quatre semaines; voir les section 2.4.3 et 4.2).

2.3 Source

On peut se procurer des élevages de D. magna ou de D. pulex auprès de maisons commerciales de fournitures biologiques et de laboratoires du gouvernement.  Pour obtenir des conseils sur les sources de daphnies convenant à l'exécution d'essais de toxicité aquatique, on peut communiquer avec les bureaux régionaux de la Protection de l'environnement (annexe A).

Pour lancer un élevage, très peu d'organismes sont nécessaires (de 20 à 30).  Si l'on a des doutes sur l'espèce de daphnies, il faut la confirmer, sur le plan taxonomique, au moyen d'un examen microscopique de la taille et du nombre des épines sur la griffe post-abdominale (figure 2) (Pennak, 1978; EPA, 1985a).  Tous les organismes utilisés au cours d'un essai doivent provenir du même élevage.

2.4 Élevage

2.4.1 Généralités

Les conditions et méthodes recommandées pour l'élevage des daphnies sont exposées ci-après; le lecteur en trouvera un résumé au tableau 1. Ces conditions et méthodes visent à laisser une certaine marge de manoeuvre aux divers laboratoires, tout en normalisant les conditions, qui, si elles n’étaient pas contrôlées, pourraient influer sur la santé et le rendement des organismes.

Certaines méthodes d'élevage fructueuses sont couramment utilisées au Canada et ailleurs (EPA, 1982; ASTM, 1984; EPA, 1985a; Greene et al., 1988; Poirier et al., 1988; BNQ, 1990).  Le présent document n'a pas pour objet de reprendre en détail les renseignements concernant ces méthodes; les personnes qui souhaitent lancer des élevages de daphnies sont donc invitées à examiner les publications indiquées pour obtenir de plus amples renseignements sur les méthodes éprouvées d'élevage de ces organismes.  Les recommandations et exigences suivantes visent à assurer un degré supérieur de normalisation et de contrôle de la qualité dans la production de daphnies en vue d'essais de toxicité aquatique.

Figure 2 Anatomie de la daphnie femelle (Sources : EPA, 1985a; Poirier et al., 1988)
Figure 2 Anatomie de la daphnie femelle (Sources : EPA, 1985a; Poirier et al., 1988)
Description longue de la figure 2

Voici une illustration de l’anatomie macroscopique d’une daphnie femelle. Il s'agit d'un dessin au trait d'une coupe longitudinale. À noter : la grande cavité d’incubation (dorsale) et l’antenne secondaire (antérieure) de grande taille utilisée pour la propulsion. Le schéma comporte également un encadré illustrant les différences sur le plan de la forme de la griffe postabdominale chez Daphnia pulex et chez Daphnia magna.

Tableau 1 Liste de contrôle des conditions et méthodes recommandées pour l'élevage des daphnies
Source de daphnies Maisons de fournitures biologiques ou laboratoires du gouvernement; espèce confirmée par examen microscopique.
Eau Eau de surface ou souterraine non contaminée, eau municipale déchlorée ou eau reconstituée; l'eau doit être remplacée au moins une fois par  semaine et la densité des daphnies réduite à 20 par litre.
Température 20 ± 2 °C pendant deux semaines aux moins avant l'essai.
Oxygénation/aération Oxygène dissous de 60 à 100 % de saturation, maintenu au besoin par aération
avec de l'air filtré et exempt d'huile.
pH Entre 6,0Note de bas de page a et 8,5 de préférence entre 6,5 et 8,5.
Dureté Correspondant, à 20 % près, à celle de l'eau de contrôle/de dilution, pendant sept jours au moins avant l'essai.
Qualité de l'eau Température, oxygène dissous et pH surveillés dans chaque réservoir de élevage, de préférence chaque jour.
Éclairement Éclairage fluorescent, de préférence «blanc froid»; entre 400 et 800 lux à la surface; lumière pendant 16 ± 1 h, obscurité pendant 8 ± 1 h.
Alimentation Cultures d'algues avec ou sans suppléments (p. ex., YCT).
Manipulation Manipulation minimale, en prenant toutes les précautions nécessaires pour verser, siphonner ou pipetter.
Critères de santé Génitrices sans éphippium; 25 % ou moins de mortalité pendant la semaine précédant l'essai; âge maximal de 12 jours à la première couvée; femelles de deux à cinq semaines, pour assurer une moyenne de 15 néonates ou plus.

2.4.2 Installations

Les daphnies doivent être élevées et conservées dans un laboratoire.  L'alimentation en air devrait être exempte d'odeurs et de poussières détectables.  Idéalement, l'installation d'élevage devrait être isolée de l'installation d'essai, afin d'éviter ou de réduire les risques de contamination des élevages par les produits volatils libérés par les échantillons et les solutions d'essai.

Les réservoirs et accessoires en contact avec des organismes et les milieux d'élevage doivent être fabriqués de matériaux non toxiques (p. ex., verre, acier inoxydable, NalgeneMC, porcelaine ou polyéthylène).  Pour les élevages en masse, on recommande l'usage d'aquariums de verre ou de bocaux à ouverture large d'une capacité de 3 L ou plus, étant donné qu'ils permettent d'observer facilement les daphnies.

Les matériaux comme le cuivre, le laiton, le métal galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel ne doivent pas entrer en contact avec les réservoirs ou les milieux d'élevage, ni avec les échantillons et réservoirs d'essai. On devrait couvrir les réservoirs d'élevage, afin de les mettre à l'abri de la poussière et de minimiser l'évaporation.

2.4.3 Gestion des élevages

Dans les élevages de masse de 3 L ou plus, l'eau de chaque réservoir devrait être replacée presque entièrement, au moins une fois par semaineNote de bas de page 2 (EPA, 1982; Greene et al., 1988). La densité de la population de daphnies devrait alors être réduite à environ 20 animaux ou moins par litre. Une valeur inférieure peut permettre d'obtenir des résultats plus satisfaisants, et une densité d'élevage de seulement quatre D. magna adultes par litre a été recommandée ailleurs, afin d'éviter la production d'éphippiums (Cowgill, 1989). Il est souhaitable de disposer d'au moins cinq réservoirs d'élevage pour chaque espèce servant aux essaisNote de bas de page 3.

D'autres méthodes ont été fructueuses; par exemple, on a utilisé des bocaux d'élevage de 1 L, en nourrissant les daphnies et en changeant l'eau trois fois par semaine. Selon ce régime, il faudrait réduire la densité des daphnies conformément à la valeur normalisée de 20 animaux ou moins par litre.

Une solution de rechange recommandée consiste à lancer de nouveaux élevages chaque semaine, en utilisant de l'eau nouvelle et des néonates provenant de l'élevage de la semaine précédente. Il faudrait conserver des élevages de trois générations successives (soit les mères, les filles et les petite-filles), en prévoyant des réservoirs en double pour chaque âge. Ainsi, on pourrait toujours disposer d'adultes de deux à cinq semaines capables de fournir des néonates pour les essais (section 4.2).

2.4.4 Éclairement

L'éclairement devrait être entre 400 et 800 lux à la surface de l'eau; idéalement, la lumière devrait tendre vers l'extrémité violette du spectre (indice de rendu des couleurs supérieur ou égal à 90) (Buikema, 1973; ASTM, 1984; Poirier et al., 1988). Des appareils fluorescents blanc froid sont indiqués, mais on peut utiliser d'autres sources d'éclairage (p. ex., des fluorescents à spectre continu), à la condition de pouvoir respecter les critères de santé définis à la section 2.4.12. La photopériode doit normalement correspondre à une séquence de 16 ± 1 h de lumière et 8 ± 1 h d'obscuritéNote de bas de page 4.

2.4.5 Eau

L'eau pour l'élevage des daphnies peut consister en un approvisionnement non contaminé d'eau souterraine ou de surface, d'eau potable municipale déchlorée ou d'eau reconstituée, corrigée pour obtenir une dureté particulière (sections 2.4.9, 4.1 et 5.3); il peut aussi s'agir d'un échantillon de milieu récepteur «en amont», prélevée dans la nappe d'eau visée par l'essai. Cette eau devrait favoriser de façon constante et fiable la survie, la santé, le développement et la reproduction des daphnies. Afin d'assurer une bonne qualité de l'eau, il faudrait effectuer, aussi souvent que nécessaire, des contrôles et des évaluations des variables comme la dureté, l'alcalinité, le chlore résiduel (si l'on utilise de l'eau municipale), le pH, le carbone organique total, la conductivité, les solides en suspension, l'oxygène dissous, les gaz totaux dissous, la température, l'azote ammoniacal, les nitrites, les métaux et l'ensemble des pesticides organophosphorés.

S'il faut utiliser de l'eau potable municipale pour l'élevage des daphnies et comme eau de contrôle/de dilution, il faut la soumettre à une déchloration efficace, de sorte qu'elle soit exempte de toute concentration nocive de chlore. La teneur en chlore résiduel total des élevages et de l'eau de contrôle/de dilution dans les récipients d'essai ne devrait pas dépasser 0,002 mg/L (CCMRE, 1987). Pour atteindre cet objectif, il est recommandé d'utiliser des filtres de charbon activé (charbon d'os), puis un rayonnement ultraviolet (Armstrong et Scott, 1974)Note de bas de page 5; par ailleurs, on peut aussi conserver l'eau dans des réservoirs et l'aérer vigoureusement pendant au moins 24 h après la filtration au charbon. Dans les cas très difficiles, on pourrait encourager la croissance d'algues dans les réservoirs d'aération de l'eau afin d'éliminer le chlore résiduel, puis filtrer l'eau avant de l'utiliser avec les daphnies.

L'eau d'élevage ne doit pas être sursaturée en gaz. Si on a lieu de croire qu'il peut y avoir sursaturation, on devrait vérifier fréquemment la pression de gaz totale de l'alimentation en eau (Bouck, 1982). Si la saturation en gaz dissous dépasse 100 %, il faut recourir à des mesures correctives (p. ex., l'utilisation de colonnes d'aération ou une aération vigoureuse dans un réservoir ouvert). Il n'est pas facile d'éliminer complètement la sursaturation; si l'on sait ou si l'on soupçonne que ce problème existe, il faudrait effectuer fréquemment des contrôles.

La température de l'eau, sa teneur en oxygène dissous et son pH devraient être contrôlés dans chaque élevage, de préférence chaque jour.

2.4.6 Température

La température de l'eau d'élevage devrait être de 20 ± 2° C.  Un incubateur, un bain-marie, une pièce à température contrôlée ou un chauffe-aquarium peuvent servir à régler la température. Si les élevages se retrouvent à une température inférieure ou supérieure, il faudrait la corriger progressivement (à raison d'au plus 3° C/d) pour la ramener à 20 ± 2° C, et la maintenir à ce niveau pendant au moins deux semaines.

2.4.7 Oxygène dissous

L'eau destinée aux élevages devrait être aérée vigoureusement avant usage, de sorte qu'elle soit saturée d'oxygène et exempte de toute sursaturation en gaz. Après l'aération, il faudrait la laisser reposer pendant environ 0,5 h avant de l'utiliser dans les élevages, pour permettre aux bulles d'air de se dissiper et pour favoriser la mise en équilibre définitive du pH ainsi que de l'oxygène et des autres gaz dissous.

La teneur en oxygène dissous des élevages ne devrait pas être inférieure à 60 % de saturation en air.  Afin de la maintenir à ce niveau, on devrait assurer, au besoin, une légère aération de chaque élevage au moyen d'air comprimé filtré et exempt d'huile (OCDE, 1981; EPA, 1982; Greene et al., 1988; Poirier et al., 1988).

2.4.8 pH

Le pH de l'eau utilisée pour l'élevage des daphnies devrait être compris entre 6,0 et 8,5.  Il est préférable d'utiliser une eau dont le pH se situe entre 6,5 et 8,5 (Poirier et al., 1988). L'élevage de D. magna requiert normalement une eau dont le pH est supérieure à 7,4 et la dureté supérieure ou égale à 80 mg/L.

2.4.9 Dureté

Lorsqu'on utilise de l'eau naturelle (eau souterraine ou de surface non contaminée ou eau municipale déchlorée) pour l'élevage et comme eau de contrôle/de dilution, il est recommandé que sa dureté se situe entre 80 et 250 mg/L si c'est D. magna qu'on élève ou qui sert aux essais, et entre 10 et 250 mg/L si l'on utilise D. pulexNote de bas de page 1. On ne devrait pas utiliser d'eaux dont la dureté est supérieure à 250 mg/L, sauf si l'on étudie l'incidence de la dureté de l'eau sur la toxicité aiguë.

On peut utiliser de l'eau reconstituée lorsqu'on a besoin d'un milieu d'élevage et d'une eau de contrôle/de dilution normalisée, ou lorsqu'on ne dispose pas d'un approvisionnement convenable en eau naturelle non contaminée.  Il est recommandé d'utiliser une eau reconstituée relativement douce; la dureté totale devrait être de 40 à 48 mg/L pour Daphnia pulexet de 80 à 100 mg/L pour Daphnia magna (sections 4.1 et 5.3).  Ces valeurs correspondent relativement bien à celles qui sont recommandées dans d'autres documents de méthodologie (annexe B), ce qui facilite les comparaisons des résultats de toxicité.

On peut obtenir une dureté particulière en préparant de l'eau reconstituée.  Le tableau 2 présente des formules permettant d'obtenir d'une dureté et d'un pH particuliers (EPA, 1985); il existe aussi d'autres formules appropriées (ISO, 1982).  On peut aussi corriger la dureté de l'eau du laboratoire (eau souterraine ou de surface non contaminée, ou eau municipale déchlorée) en la diluant, si elle est trop dure, ou en y ajoutant de l'eau dure reconstituée ou des proportions et des quantités appropriées de sels, si elle est trop douce.

Que l'on utilise de l'eau naturelle ou de l'eau reconstituée comme milieu d'élevage et comme eau de contrôle/de dilution, les daphnies doivent être élevées pendant au moins sept jours dans une eau d'une dureté identique ou semblable à celle de l'eau de contrôle/de dilution employée pour les essaisNote de bas de page 6. Sauf dans des circonstances spéciales ou lorsque les besoins de l'essai l'imposent, on devrait utiliser le même approvisionnement en eau comme milieu d'élevage et comme eau de contrôle/de dilution.

2.4.10 Alimentation

Il faut nourrir les daphnies pendant leur élevage. La nourriture utilisée devrait être offerte en quantité suffisante et permettre de maintenir les organismes dans un état nutritif qui soutienne leur activité métabolique normale et qui soit conforme aux critères de santé définis à la section 2.4.12.  Les suggestions suivantes pourront permettre d'éviter les problèmes connus.

La documentation (EPA, 1982; ASTM, 1984; EPA, 1985a; Colombie-Britannique, 1988; Greene et al., 1988; Poirier et al., 1988) décrit dans les détails un certain nombre de régimes, de rations alimentaires et de calendriers éprouvés pour l'élevage des daphnies. Les méthodes d’alimentation et d’élevage de Goulden et al. (1982) ont connu du succès. L'alimentation avec des cultures de laboratoire d'algues vertes (Selenastrum capricornutum ou Chlorella pyrenoidosa) est répandue (EPA, 1982; Poirier et al., 1988) et souhaitable; un mélange de deux ou plusieurs espèces est avantageux, en particulier un mélange d'algues vertes et d'une diatomée telle que Nitzschia frustulum (Cowgill, 1989). On sait également que les daphnies se développent bien lorsqu'elles sont nourries de Scenedesmus acutus. Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii et Ankistrodesmus convolutus (ou A. faculatus) sont d'autres espèces d'algues qui ont été utilisées. La collection de cultures de l'université de Toronto est une source de cultures pour ces espèces; on peut aussi en obtenir dans certaines maisons commerciales de fournitures biologiques. Pour pouvoir offrir aux daphnies les nutriments qui leur conviennent, chaque espèce d'algue doit croître dans un milieu de culture convenable.

Département de botanique,
Université de Toronto,
Toronto (Ontario)
M5S 1A4.
Téléphone : (416) 978-3641; télécopieur : (416) 978-3884.

À titre de solution de rechange, ou de pair avec les algues, on a aussi utilisé une nourriture préparée composée d'une moulée de levure et de truite (EPA, 1985a; Colombie-Britannique, 1988; Greene et al., 1988) ou d'une moulée de levure, de CerophyllMC et de truite (YCT) (EPA, 1989). On a également utilisé avec succès, à titre de supplément alimentaire, une suspension de nourriture pour poissons tropicaux de marque TetraminMCNote de bas de page 33. Cependant, un régime entièrement artificiel (p. ex., reposant exclusivement sur de la moulée de truite ou de la levure) n'est pas recommandé, car il peut abréger la vie des néonates et réduire leur résistance aux substances toxiques (Cowgill, 1989). On a relevé dans certaines nourritures commerciales pour poissons des niveaux indésirables de pesticides ou de métaux et de BPC; par conséquent, certains expérimenteurs préfèrent n'utiliser que de la levure, du CerophyllMC ou une combinaison de ces deux produits comme supplément pour l'élevage des daphnies. Dans l'ensemble, l'expérience des laboratoires au Canada donne à croire qu'il faudrait utiliser au moins une et, de préférence, deux ou plusieurs espèces d'algues, peut-être avec un supplément de levure, de moulée de truite ou de CerophyllMC.

On trouvera à l'annexe C des formules permettant de préparer de la moulée de levure, de CerophyllMC et de truite (YCT) et un concentré d'algues (Selenastrum capricornutumou un mélange d'espèces d'algues) pour nourrir les élevages de daphnies.  Si l'on y a recours, on devrait nourrir les daphnies à raison de 7 mL d'YCT et de 7 mL de concentré d'algues par litre (EPA, 1989). On devrait mélanger parfaitement le concentré d'algues et l'YCT (annexe C) en les agitant ensemble avant de les distribuer. Si l'YCT est congelée, les aliquotes dégelées pour utilisation devraient être conservées dans un réfrigérateur sans être recongelées.  Les portions inutilisées d'YCT non congelée ou dégelée devraient être jetées après deux semaines.  Les portions inutilisées de concentré d'algues devraient être conservées au réfrigérateur et jetées après un mois.

Une carence en vitamine B12 ou en sélénium peut nuire à l'état de santé des daphnies; il faudrait donc en ajouter régulièrement à l'eau d'élevage, du moins si l'on utilise de l'eau reconstituée.  Le sélénium devrait être ajouté à raison de 2 µg par litre, au moyen de sélénate de sodium (Na2SeO4). Une insuffisance en sélénium dans l'eau peut entraîner la détérioration de la carapace externe des daphnies, réduire leur espérance de vie et empêcher leur progéniture de parvenir à maturité et de se reproduire, d'après les conclusions des travaux effectués par Keating et Dagbuson (1984), telles que citées par Cowgill (1989).  Il faudrait aussi ajouter de la vitamine B12à l'eau d'élevage artificielle à raison de 2 µg/L de cyanocobalamine.  Les solutions mères de vitamine B12sont instables et ne devraient pas être stockées pour plus de deux semaines.  Une carence de cette vitamine peut retarder la reproduction, causer un réduction de la fréquence des mues et empêcher la progéniture de se reproduire (Cowgill, 1989; d'après Keating, 1985).

Le choix définitif de la ration et du régime d'alimentation est laissé à la discrétion de chaque laboratoire, en fonction de son expérience et de sa réussite quant au respect des critères de santé précisés pour les organismes élevés (section 2.4.12).

Tableau 2 Préparation d'eau reconstituée d'une dureté particulière
Type d'eau Réactif ajoutéNote de bas de page a.1 (mg/L)
NaHCO3
Réactif ajoutéNote de bas de page a.1 (mg/L)
CaSO4 A 2H2O
Réactif ajoutéNote de bas de page a.1 (mg/L)
MgSO4
Réactif ajoutéNote de bas de page a (mg/L)
KCl
Qualité définitive de l'eau
DuretéNote de bas de page b
Qualité définitive de l'eau
pHNote de bas de page c
Très douce 12,0 7,5 7,5 0,5 10-13 6,4-6,8
Douce 48,0 30,0 30,0 2,0 40-48 7,2-7,6
Modérément dure 96,0 60,0 60,0 4,0 80-100 7,4-7,8
Dure 192,0 120,0 120,0 8,0 160-180 7,6-8,0
Très dure 384,0 240,0 240,0 16,0 280-320 8,0-8,4

2.4.11 Manipulation des organismes

On peut transférer des daphnies adultes d'un contenant à un autre en versant doucement le liquide où elles se trouvent, sans risquer d'emprisonner de l'air sous leur carapace ni de leur causer d'autres dommages appréciables.  On peut retirer des réservoirs d'élevage les daphnies adultes convenant à la création d'une colonie d'élevage (c.-à-d. d'une source de néonates) en les pipettant ou en les siphonnant doucement dans un tamis de calibre approprié (p. ex., avec des mailles de 2 mm sur 1mm), puis en les transférant rapidement dans un autre contenant (section 4.2).

La manipulation et le transfert des néonates devraient être réduits au minimum, et il faut protéger les réservoirs d'élevage contre les chocs. Les jeunes daphnies sont vulnérables à l'emprisonnement d'air et devraient être d'une pipette de verre.  Un pipette jetable dont l'extrémité d'éjection est coupée et polie à laflamme pour assurer une ouverture de 5 mm est idéale à cette fin (EPA, 1985a; Greene et al., 1988).  L'extrémité de la pipette devrait rester sous la surface de l'eau quand on libère les daphnies (ASTM, 1984).

2.4.12 Critères de santé

Les élevages de daphnies devant servir à des essais de toxicité devraient respecter les critères suivants en matière de santé (Hebert, 1978; Plotkin et Ram, 1983; Colombie-Britannique, 1988; Poirier et al., 1988; APHA et al., 1989) :

  • Il ne doit pas avoir d'éphippiums dans l'élevage.
  • Il ne faut pas enregistrer plus de 25 % de décès dans le stock de génitrices au cours des sept jours précédant l'essai, s'il s'agit d'un élevage regroupant plusieurs groupes d'âge.
  • Les daphnies devraient être âgées d'au plus 12 jours au moment de leur première couvée.
  • Les femelles de deux à cinq semaines doivent produire une moyenne de 15 néonates ou plus par couvée; une couvée de 20 néonates devrait être facile à obtenir.

On peut suivre de près l'état de santé des élevages en vérifiant fréquemment le temps écoulé jusqu'à la première couvée et le nombre moyen de néonates par couvée (Poirier et al., 1988).  Pour établir ces indices sur la santé, on peut placer quelques néonates (âgées de moins de 24 h) dans des béchers de verre, les conserver dans les mêmes conditions que l'élevage principal et consigner le temps écoulé jusqu'à la première couvée et le nombre moyen de néonates par couvées au cours d'une période d’observation de
21 jours.

L'essai de sensibilité des daphnies à un produit toxique de référence (section 4.6) fournit un autre indice de l'état de santé de l'élevage et son aptitude à subir un essai de toxicité.

Section 3 : Système d'essai

3.1 Installations

L'essai peut être effectué dans un bain-marie, un simulateur d'environnement ou une installation équivalente avec réglage de température (20 ± 2° C). Cette installation devrait être isolée des bouleversements physiques qui peuvent influencer les organismes soumis à l'essai. Étant donné qu'il faut contrôler la photopériode (section 3.2), l'installation doit consister en un laboratoire distinct ou en une partie de laboratoire entourée de rideaux (p. ex., en plastique noir). La poussière et les émanations devraient être réduites au minimum.

Les matériaux de construction et tout appareil pouvant entrer en contact avec l'eau de contrôle/de dilution ou les solutions d'essai dans lesquelles les organismes seront déposés ne devraient pas renfermer de substances susceptibles de dénaturer par lixiviation les solutions d'essai ou d'accroître la sorption de la substance à expérimenterNote de bas de page 7 (section 2.4.2).  Le laboratoire doit être doté des appareils permettant de mesurer les variables fondamentales de la qualité de l'eau (température, conductivité, oxygène dissous et pH), et l'on doit être prêt à effectuer une analyse rapide et exacte d'autres variables, comme la dureté et le chlore résiduel.

3.2 Éclairement

Les conditions d'éclairement auxquelles les organismes sont soumis devraient être identiques à celles définies à la section 2.4.4. À noter cependant que l'intensité de la radiation ultra- violette (UV-B) obtenue avec un éclairage fluorescent blanc froid ou des fluorescents à spectre continu ne se rapproche pas de celle obtenue avec un éclairage naturel, et que la toxicité de certains effluents et produits chimiques peut être fortement altérée par des réactions photolytiques causées par les rayons UV-B. Pour certains essais (p.ex., photo- activation ou photodégradation de matières toxiques causées par les rayons UV), des éclairages spéciaux (p. ex., lampes à vapeur de mercure à haute pression) dotés de caractéristiques spectrales différentes peuvent convenir. Des informations utiles sont données à ce sujet dans la publication de l'ASTM (1995). Les études visant à déterminer l'influence de l'éclairement sur la toxicité pourraient comprendre des comparaisons juxtaposées avec des réplicats de solutions exposées à des conditions d'éclairement différentes (p. ex., éclairage fluorescent blanc froid versus lampe à vapeur de mercure haute pression). La photopériode (en principe 16 ± 1 h de lumière et 8 ± 1 h d'obscurité) doit être établie pour coïncider avec celle à laquelle les organismes ont été acclimatés.

3.3 Récipients d'essai

Les récipients d'essai doivent être en verreNote de bas de page 8 ou en plastique transparent.  On peut utiliser des béchers de verre borosilicaté (d'une capacité de 150 ou de 250 mL) ou des éprouvettes de verre (Poirier et al., 1988).  On peut également utiliser des sacs de plastique non toxique et inerte (p. ex., Whirl-PakMC), sauf pour les essais de produits chimiques (section 5.2).  Le récipient retenu devrait être assez grand pour permettre que la densité de chargement ne soit pas supérieure à une daphnie par 15 mL de solution d'essai.

3.4 Eau de contrôle/de dilution

Le choix de l'eau de contrôle/de dilution dépend d’un certain nombre de variables, notamment la substance à expérimenter et l'objet de l'essai (sections 5 à 7), la dureté des solutions d'essai ainsi que la dureté et la nature de l'eau à laquelle les organismes ont été acclimatés (section 2.4). En conséquence, l'eau de contrôle/de dilution peut être : de l'eau souterraine; de l'eau de surface non pollué (provenant d'un cours d'eau ou d'un lac); de l'eau municipale déchlorée provenant d'une source non contaminée; de l'eau reconstituée d’un pH et d'une dureté particuliers (sections 2.4.9 et 4.1); ou un échantillon de milieu récepteur recueilli en amont ou àproximité de la source de contamination, mais à l'abri de son influence.  Les conditions relatives au prélèvement, au transport et au stockage des échantillons de milieux récepteurs devraient être conformes aux dispositions de la section 6.1. Idéalement, l'eau de d'élevage de contrôle/de dilution devrait être de qualité identique ou essentiellement semblable, et la dureté de toutes les solutions d'essai ne devrait pas différer appréciablement de celle de l'eau d'élevage. Malgré tout, en raison de l'objet de l'essai (p. ex., évaluation de milieux récepteurs pour déterminer les effets toxiques d'un déversement de produits chimiques), ou encore de problèmes d'ordre pratique, logistique ou financier, on peut être amené à choisir une eau de contrôle/de dilution inférieure à la qualité optimale.  La dureté de cette eau doit être connue avant le début de l'essai, puisqu'elle peut influer sur l'espèce de daphnies à utiliser (sections 2.1 et 2.4.9).

Section 4 : Méthodes d'essai universelles

Les méthodes exposées dans la présente section s'appliquent à l'ensemble des essais d'eaux usées et de produits chimiques visés dans les sections 5, 6 et 7.  Tous les aspects du système d'essai défini dans la section précédente doivent leur être intégrés.

Le tableau 3 fournit une liste de contrôle récapitulative des méthodes recommandées pour tous les essais de toxicité létale aiguë sur des daphnies et pour ceux portant sur des types de substances particuliers.

4.1 Préparation des solutions d'essai

Tous les réservoirs, dispositifs de mesure, appareils d'agitation et contenants servant pour le transfert des daphnies doivent être nettoyés et rincés à fond, conformément à de bonnes pratiques de laboratoire.  Des méthodes de nettoyage appropriées on  été établies par l’ASTM (1984).

On peut préparer de l’eau reconstituée d’une dureté particulièreNote de bas de page 6 pour l’utiliser comme eau de contrôle/de dilution. Le tableau 2 indique les types et les quantités de produits chimiques de qualité «réactif» qu’il faut ajouter à de l’eau distillée ou désionisée pour obtenir de l’eau de contrôle/de dilution (ou un milieu d’élevage) possédant une dureté, une alcalinité et un pH particuliers (ASTM, 1980; EPA, 1985a). D’autres formules, qui ont été utilisées avec succès, ont été établies par l’ISO (1982). Les formules prévues pour l’eau «douce» et l’eau «modérément dure» sont recommandées pour la préparation d’eaux normalisées destinées à Daphnia pulex et D. magna respectivement (section 2.4.9). L’eau reconstituée devrait être aérée vigoureusement dans un réservoir non toxique pour une durée d’au moins 24 h avant son utilisation (EPA, 1985a).

De l’eau souterraine non contaminée, de l’eau de surface naturelle ou de l’eau municipale déchlorée peuvent également subir une correction de leur dureté et servir comme eaux de contrôle/de dilution.  On peut en effet diluer l’eau en cause avec de l’eau désionnée ou distillée (si elle est trop dure), ou augmenter sa dureté par l’addition d’une proportion et d’une quantité appropriée de produits chimiques de qualité «réactifs» (tableau 2).  La dureté de l’eau de contrôle/de dilution doit correspondre, à 20 % près, à celle de l’eau utilisée pour l’élevage des organismes soumis à l’essaiNote de bas de page 6 (section 2.4.9).

L’eau de contrôle/de dilution utilisée pour les essais sur les daphnies doit être amenée à la température d’essai (normalement, 20 ± 2° C) avant d’être utilisée.  La saturation de cette eau en gaz excédentaires doit être évitée (section 2.4.5).

Avant d’être utilisée, l’eau de contrôle/de dilution devrait avoir une teneur en oxygène dissous de 90 à 100 % de la valeur de saturation en air.  Au besoin, on devrait aérer vigoureusement le volume nécessaire d’eau de contrôle/de dilution (au moyen d’un jet d’air par comprimé exempt d’huile passant par des pierres de barbotage) immédiatement avant de l’utiliser, et vérifier sa teneur en oxygène dissous afin de confirmer que le niveau de saturation de 90 à 100 % a été atteint.

Tableau 3a Liste de contrôle des conditions et méthodes d'essai recommandées (Méthodes Universelles)
Type d'essai Statique, durée de 48 hNote de bas de page a.2
Eau de contrôle/de dilution Eau souterraine ou eau de surface non contaminée ou municipale déchlorée; eau reconstituée s’il faut assurer un degré élevé de normalisation; milieu récepteur «en amont» pour évaluer l’effet toxique à un endroit précisNote de bas de page b.1; oxygène dissous (OD) de 90 à 100 % de saturation au moment de l'utilisation.
Organismes Néonates de Daphnia magna ou de D. pulex; au moins dix organismes par concentration; densité de chargement maximal : une daphnie par 15 mL.
Température 20 ± 2° C
Oxygène/aération Aucune aération pendant l’essai.
pH Aucune correction si le pH de la solution d'essai est compris entre 6,0 et 8,5Note de bas de page c.1; un deuxième essai (à pH corrigé) peut s'avérer nécessaire ou pertinent si le pH de l'échantillon ou de la solution n'est pas compris dans cet intervalle.
Éclairement Fluorescent, de préférence «blanc froid»; entre 400 et 800 lux à la surface; normalement, 16 ± 1 h de lumière et 8 ± 1 h d'obscurité.
Alimentation Ne pas nourrir les organismes pendant l'essai.
Observations Mort et comportement atypique (p.  Ex., immobilité, léthargie, rotation, flottaison), au moins au début et à la fin d’essai.
Mesures Température, pH et OD de la solution, au moins au début et à la fin de l'essai; conductivité, au moins au début; dureté.
Résultats Conformément aux précisions fournies ou selon l'objet de l'essai et la substance à expérimenter; il peut s'agir d'établir la CL50 après 48 h (nécessitant des limites de confiance à 95 %) ou d'un essai à concentration unique (pourcentage de mortalité après 48 h ou moins; TL50).
Produits toxiques de référence Un ou plusieurs des composés suivantes : sulfate du zinc, chlorure de sodium ou bichromate de potassium; essai statique de CL50 après 48 h, dans les 14 jours précédant ou suivant l’essai.
Validité de l'essai L'essai n'est pas valable si plus de 10 % des organismes témoins meurent ou ont un comportement manifestement stressé (p. ex., immobilité).
Tableau 3b Liste de contrôle des conditions et méthodes d'essai recommandées (Produit Chimiques)
Solvants À utiliser seulement dans des cas particuliers.
Concentration Il est recommandé de mesurer la concentration au début et à la fin de l'exposition, dans les solutions à teneur supérieure, moyenne et inférieure et dans les solutions de contrôle; si les concentrations diminuent de plus de 20 %, réévaluer en utilisant un essai à renouvellement continu ou périodique.
Eau de contrôle/de dilution Selon l’objet de l’essai; eau reconstituée s'il faut assurer un degré élevé de normalisation; milieu récepteur pour étudier les effets toxiques locaux; sinon, eau du laboratoire non contaminée.
Tableau 3c Liste de contrôle des conditions et méthodes d'essai recommandées (Effluents et Lixiviats)
Transport et stockage Transport à la température ambiante (plus de 1°C, moins de 30 °C) ou entre 1 et 8°C si le délai de transport est supérieur à deux jours; les échantillons ne devraient pas geler pendant le transport; stocker dans l'obscurité entre 1 et 8°C (de préférence à 4 ± 2° C); l'essai devrait commencer dans les trois jours et doit être mis en route dans les cinq jours du prélèvement des échantillons.
Eau de contrôle/de dilution Selon l’objet de l’essai; eau du laboratoire, eau reconstituée ou milieu récepteur «en amont» pour les essais de surveillance et de conformité.
Tableau 3d Liste de contrôle des conditions et méthodes d'essai recommandées (Élutriats)
Transport et stockage Procéder à l'extraction dans les sept jours de la réception des échantillons; conserver dans l'obscurité entre 1 et 8°C (de préférence à 4 ± 2°C); effectuer l'essai dans les dix jours de la réception des échantillons.
Eau de contrôle/de dilution Conformément aux précisions fournies ou selon l'objet de l'essai; eau reconstituée s'il faut assurer un degré élevé de normalisation.
Tableau 3e Liste de contrôle des conditions et méthodes d'essai recommandées (Milieux récepteurs)
Transport et stockage Comme pour les effluents et lixiviats.
Eau de contrôle/de dilution Selon l'objet de l'essai; milieu récepteur «en amont» pour les effets locaux.

Les concentrations d’essai et le nombre de solutions d’essai à préparer dépendent de l’objet de l’essai.  Les essais de surveillance et de conformité portent sur des eaux usées ou des milieux récepteurs peuvent, dans certains cas, exiger la préparation d’une seule concentration d’essai (p. ex., l’échantillon non dilué) et d’une solution de contrôle (sections 6 et 7). Pour chaque essai visant à y établir une CL50 définitive après 48 h, il faut préparer au moins cinq concentrations d'essai ainsi qu'une solution de contrôle (eau de dilution à 100 %)Note de bas de page 9.  On peut utiliser une série géométrique de dilutions, dans laquelle chaque concentration successive s'établit à environ 50 % de la précédente (p. ex., 100, 50, 25, 12,5, 6,3), afin de faciliter le calcul précis de la CL50 et de ses limites de confiance à 95 %. On peut aussi choisir les concentrations d'essai à partir d'une série logarithmique appropriée de dilutions (annexe D).

On peut prévoir, si on le souhaite, des répétitions de chaque concentration d’essai.  Cela offre un avantage considérable, puisqu’on peut alors utiliser deux estimations ou plus de la CL50 (ou de la CE50, section 4.4) dans l’examen statistique des écarts par rapport aux résultats obtenus dans d’autre laboratoires, à d’autre moments, pour une autre espèce, etc., en supposant que ces autres essais prévoyaient également des répétitions.  La précision de l’estimation de la CL50 ou de la CE50 (mais pas nécessairement son exactitude) augmente également du seul fait qu’on utilise un plus grande nombre d’organismes.  Cette façon de procéder peut convenir particulièrement bien à l’évaluation de nouveaux produits chimiques (section 5.2).

Si l’on utilise un milieu récepteur comme eau de contrôle/de dilution, il faudrait préparer une deuxième solution de contrôle en utilisant l’eau du laboratoire à laquelle les organismes ont été acclimatés pendant deux semaines ou plus.  On ne peut utiliser de l’eau d’amont si elle est manifestement toxique selon les critères de l’essai auquel elle est destinéeNote de bas de page 10; en pareil cas, l’eau du laboratoire à laquelle les daphnies ont été acclimatées devrait être utilisée comme eau de contrôle et pour l’ensemble des dilutions. Pour un essai donné, il faut utiliser la même eau afin de préparer la solution de contrôle et toutes les concentrations d’essai.

Il se peut qu’on doive corriger le pH des échantillons ou des solutions.  Des solutions d’acide chlorhydrique (HCl) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH) de titre inférieur ou égal à 1 N devraient normalement être utilisées pour toutes les opérations de correction du pH.  Certaines situations (p. ex., des échantillons d’effluents à pouvoir tampon élevé) peuvent exiger l’utilisation de teneurs supérieures d’acide ou de base.

Abernethy et Westlake (1989) fournissent des lignes directrices utiles pour la correction du pH. Il faudrait laisser s’équilibrer, après chaque addition d’acide ou de base, les solutions d’essai ou les aliquotes d’échantillons faisant l’objet d’une correction du pHNote de bas de page 11. On devrait veiller à éviter toute modification excessive du pH.  Le délai nécessaire pour atteindre l’équilibre dépend du pouvoir tampon de la solution ou de l’échantilllon.  Pour les échantillons d’effluents, il est recommandé de prévoir une durée de 30 à 60 minutes pour la correction du pH (Abernethy et Westlake, 1989).

S'il se peut que la dureté de l'échantillon d'essai (p. ex., eau usée ou milieu récepteur) soit très faible (moins de 25 mg/L) et si l'organisme prévu pour l'essai est D. magna, il faut mesurer la conductivité de l'échantillon après qu'il ait atteint la température ambiante mais avant toute dilution. Si la conductivité est de ≤l00 µohms/cm, il faut mesurer la dureté de l'échantillon. Lorsque l'analyse confirme que la dureté de l'échantillon est inférieure à 25 mg/L, il faudrait soit utiliser D. pulex pour l'essai, soit, s'il faut utiliser D. magna, corriger la dureté de l'échantillon pour qu'elle s'établisse à 25 mg/L. Cette correction devrait être effectuée par l'addition de la proportion et de la quantité appropriées de produits chimiques de qualité «réactif» requis à cette fin (section 2.4.9.). On doit mélanger parfaitement tout échantillon dont la dureté est corrigée et confirmer sa dureté avant de l'utiliser. À cette exception près, il ne faut pas corriger la dureté de l'échantillon.

Lorsqu’on veut connaître l’influence de la dureté de la solution sur la toxicité de l’échantillon, on devrait au moins mesurer la dureté de la solution de contrôle et des solutions d’essai à teneur inférieure et supérieure, avant le début de l’essai. Ces messures préalables portent sur des volumes de solutions préparés dans des béchers, une fois apportée toute correction du pH, immédiatement avant qu’on remplisse les récipients d’essai.

Si (et seulement si) la teneur en oxygène dissous mesurée à ce moment dans l'échantillon (p. ex., effluent soumis à l'essai) ou dans une ou plusieurs solutions d'essai (p. ex., substance chimique testée) est inférieure à 40 % ou supérieure à 100 % de saturation en air, l'échantillon ou toutes les solutions d'essai devraient être préaérés avant l'exposition des daphnies. On utilisera pour cela de l'air comprimé exempt d'huile et un diffuseur d'airNote de bas de page 12 propre en verre de silice ou une pipette de verre jetable. Le débit de préaération de l'échantillon ou des solutions d'essai devrait s'établir entre 25 et 50 mL/min.L, et la durée de préaération devrait être limitée à 30 minutes, qu'on ait obtenu ou non de 40 à 100 % de saturation. Les solutions d'essai contenant suffisamment d'oxygène (de 40 à 100 % de saturation en air) ne devraient pas être aérées ni avant ni pendant l'essai.

4.2  Mise en route de l'essai

L’essai doit porter sur des néonates (âgées d’au plus 24 h) de D.  magna ou de D.  pulex.  Pour en obtenir le nombre nécessaire, il faut enlever des élevages les femelles adultes portent des embryons dans leur cavité d’incubation, 24 h avant le debut de l’essai.  Ces femelles devraient de préférence être âgées de deux à cinq semaines (section 2.4.3). On transfère ensuite ces adultes dans des béchers de verre propres (d’une capacité de 400 mL ou 1 L) renfermant de l’eau de contrôle/de dilution et un inoculum d’aliments préparés fournissant la même concentration de nourriture que celle qui est utilisée pour l’élevage (section 2.4.10).  L’eau de contrôle/de dilution doit au préalable avoir été amenée à la température d’essai (20 ± 2° C) et saturée avec de l’oxygène dissous; l’eau dans les béchers de transfert ne devrait pas être aérée.  La densité de population dans ces contenants devrait être d’environ 10 adultes par litre ou moins (Poirier et al., 1988).

Les jeunes daphnies que l’on retrouve dans les béchers le lendemain sont utilisées pour l’essai de toxicité.  Normalement, cinq béchers renfermant chacun dix adultes permettent un essai de toxicité (Greene et al., 1988).

Dans la production des néonates, il est recommandé, même si ce n’est pas absolument nécessaire, de connaître approximativement l’âge des adultes, afin d’éviter l’utilisation de femelles jeunes ou sénescentes.  Les daphnies peuvent ne produire que deux ou trois jeunes organismes au cours de la premiere couvée; ce nombre peut ensuite passer à 20 ou plus, mais diminue avec la sénescence.  Certains auteurs recommandent d’éviter l’utilisation de la première couvée (Goulden et al., 1982) ou des trois premières couvées (Cowgill et al., 1985; Cowgill, 1989).  Il est recommandé d’utiliser des femelles âgées de deux à cinq semaines, afin d’obtenir une de leurs couvées «intermédiaires».  Pour ce faire, il faut aménager des réservoirs d’élevage distincts à intervalles périodiques et y déposer des néonates ou des groupes de néonates d’âge connu; une fois que ces organismes ont atteint l’âge approprié de deux à cinq semaines, on peut les utiliser pour produire des néonates pour les essais (section 2.4.3).

Dans la plupart des cas, les récipients d'essai ne comportent pas de couvercle et sont ouverts. Si l'on pense que l'effluent ou autres échantillons peuvent contenir des substances volatiles et que l'on désire étudier l'effet qu'elles peuvent avoir sur la toxicité, un essai en parallèle pourrait être conduit dans des récipients fermés, en ne laissant qu'un vide d'air minime au-dessus de la solution d'essai. Lorsque l'on sait que l'effluent ou autres échantillons renferment des substances chimiques volatiles, on pourrait exiger que les essais soient conduits dans des récipients fermés.

Chaque récipient placé dans l’installation d’essai doit porter un code ou une étiquette précisant clairement la substance à expérimenter et sa concentration, ainsi que la date et l’heure du début de l’essai.  Les récipients devraient être installés de façon à faciliter l’observation du comportement et de la mortalité des daphnies. De préférence, les solutions d’essai devraient être placées selon un ordre aléatoire (Sprague, 1973).

Avant la mise en route de l’essai, la température, la teneur en oxygène dissous et le pH des solutions d’essai devraient être vérifiés et, si cela est nécessaire ou permis, corrigé pour s’établir à des niveaux admissbiles.  La conductivité de chaque solution d’essai devrait également être mesurée et consignée à ce moment.  Les diverses possibilités qui s’offrent pour la correction du pH sont exposées à la section 4.3.2.  Chaque solution d’essai devrait être bien mélangée, au moyen d’une baguette de verre, d’un agitateur en téflon ou d’un autre dispositif non réactif, avant l’introduction des organismes.

Il faut déposer, dans chaque solution d’essai et dans l’eau de contrôle, des nombres égaux de daphnies néonates, soit au moins dix dans chaque solution, sans dépasser la densité de chargement d’au plus un individu par 15 mL.  L’ordre selon lequel on dépose les daphnies dans les récipients d’essai devrait être établi au hasard au préalable.

On devrait transférer les daphnies dans les récipients d’essai le plus rapidement possible, en ajoutant un minimum d’eau d’élevage et en imposant le moins possible de stress aux organismes (section 2.4.11).  On devrait maintenir l’extrémité de la pipette sous la surface de la solution d’essai pendant qu’on libère les organismesNote de bas de page 13.  Il faudrait vérifier les néonates immédiatement au moment du transfert; celles qui flottent ou qui sont blessées devraient être remplacées.  Il faut également éliminer tous les organismes qu’on échappe ou qui sont blessés pendant le transfert.  Les pipettes servant au transfert devraient être nettoyées à fond entre les transfers si elles sont entrées en contact avec une solution d’essai; elles devraient au moins être rincées dans de l’eau de contrôle/de dilution.

4.3  Conditions de l'essai

L'essai doit être statiqueNote de bas de page du tableau 14 (pas de renouvellement des solutions pendant l'essai) et durer 48 h.

La température d'essai devrait être de 20 ± 2°C.

La densité de chargement des daphnies dans les solutions d'essai ne devrait pas dépasser un organisme par 15 mL.

Il ne faut pas nourrir les daphnies pendant l'essai.

Les solutions d'essai ne doivent pas être aérées.

L’essai n’est pas valable si plus de 10 % des daphnies dans l’eau de contrôle meurent ou laissent apparaître un comportment atypique ou stressé (p. ex., immobilité). Dans ce cas, il faudrait examiner l’état de santé apparent des organisms d’élevage en vérifiant leur rendement reproducteur (section 2.4.12), et chercher s’il y a des traces de chlore dans l’eau (lorsqu’on utilise de l’eau municiplae déchlorée) ou s’il se pose des aspects de l’élevage.  La recherche devrait se poursuivre jusqu’à ce que la mortalité ou le comportement atypique des organismes témoins ait pratiquement disparu.

4.3.1 Oxygène dissous

Si la concentration en oxygène dissous dans un récipient d’essai devient inférieure à 40 % de la valeur de saturation en air ou à environ 5,5 mg/L, le stress créé par la faible teneur en oxygène pourrait interagir avec celui causé par les substances toxiques, les faisant paraître plus toxiques, qu’elles ne le sontNote de bas de page 15. Dans certains cas, cela est acceptable comme partie intégrante de l’action d’un effluent ou d’un autre échantillon, mais le résultat obtenu pour un récipient d’essai ne saurait être valable si la concentration en oxygène dissous devient inférieure à 40 % de saturation en raison de méthodes d’essai inadéquates, par exemple une teneur en oxygène dissous insuffisante de l’eau de contrôle/de dilution au moment de la préparation des solution d’essai.  Lorsque les méthodes sont satisaisantes (d’après les contrôles) et qu’il est souhaitable d’évaluer l’effet des substances toxiques sans l’action modificatrice de la faible teneur en oxygène, on devrait réaliser un essai à renouvellement périodique ou continuNote de bas de page 16 (section 5.4).

4.3.2 pH

Les essais de toxicité devraient normalement être effectués sans correction du pH.  Il se peut que l'échantillon de produit chimique, d'eaux usée ou de milieu récepteur produise, pour une solution d'essai, un pH qui se situe en dehors de l'intervalle de 6,50 à 8,5, et que l'on cherche à évaluer des produits chimiques toxiques plutôt que les effets létaux ou modificateurs du pH; en pareil cas, on devrait corriger le pH des solutions d'essai ou de l'échantillon avant d'y déposer les daphnies, ou effectuer parallèlement un deuxième essai (avec correction du pH)Note de bas de page 17. Pour ce deuxième essai, avant l'exposition des daphnies, le pH initial de l'échantillon ou de chaque solution d'essaiNote de bas de page 11 peut, selon les objectifs de l'essai, être neutralisé (corrigé à une valeur de 7,0) ou ramené à des valeurs correspondant, à 0,5 unité près, au pH de l'eau de contrôle/de dilution.Selon une autre démarche admissible pour ce deuxième essai, on peut ramener le pH de chaque solution d'essai (y compris les solutions de contrôle) à une valeur de 6,0 à 6,5 (si l’échantillon d'essai a ou produit un pH inférieur à 6,0) ou de 8,0 à 8,5 (si l'échantillon a ou produit un pH supérieur à 8,5)(Abernethy et Westlake, 1989). Une fois l’essai mis en route, on surveille (section 4.4), sans corriger, le pH de chaque solution.

Si l'essai de toxicité vise à mieux comprendre la nature des produits toxiques présent dans un échantillon d'effluent, d'élutriat, de lixiviat ou de milieu récepteur, on utilise souvent la correction du pH parmi un certain nombre de techniques de traitement (p. ex., l'oxydation, la filtration,l'extraction à l'air et l'addition d'agents chélateurs) pour caractériser la toxicité de l'échantillon.  Mount et Anderson-Carnahan (1988) comptent la correction du pH parmi neuf techniques d'«Évaluation d'identification de la toxicité» (EIT) qui, lorsqu'on les applique à des échantillons aqueux de toxicité aiguë, constituent des méthodes utiles permettant de déterminer la nature physique ou chimique des produits toxiques et leur sensibilité à la détoxication.

4.4 Observations et mesures

On devrait observer les daphnies dans chaque récipient d'essai au début et à la fin de l'essai, au minimum.  D’autres observations peuvent être justifiées pendant la période initiale de 24 h, selon les effets constatés et l’objet de l’essai.  Par exemple, les expérimentateurs qui veulent obtenir des renseignements sur l’évolution de la situation pendant l’essai pourraient ajouter des observation à 1, 4 et 24 h. Dans tous les cas, il faudrait effectuer des observations générales du comportement et de l’activité des daphnies immédiatement au début de l’essai, puisque les daphnies peuvent être temporairement engourdies ou immobilisées par le produit toxique.  La durée de 48 h permet à toutes les daphnies de connaître une mue, au moment de laquelle elles sont le plus sensibles, sans toutefois prolonger l’essai au point que l’inanition devienne un facteur important.

Il est plus facile d’observer les daphnies si l’on éclaire temporairement chaque récipient d’essai de côté ou en dessous, en le déposant sur un boîte d’éclairage ou en faisant appel à un autre moyen. Un fond noir est également avantageux; il peut être combiné à un éclairage favorable si l’un est placé sur le côté et l’autre en dessous.

Pour les solutions d’essai rendues opaques en raison de leur couleur ou de la présence de solides en suspension, les observations se limitent à celles qui sont faites à la fin de la période d’exposition (48 h).  La solution d’essai devrait alors être versée dans des récipients peu profonds (p. ex., des boîtes de Pétri). S’il est toujours impossible de faire des observations, on peut verser doucement les solutions dans un tamis à mailles fines (p. ex., une épuisette pour aquarium à mailles de 0,1 m) et remettre en suspension le contenu dans de l’eau de contrôle/de dilution pour établir le nombre de daphnies survivantes et observer leur comportement. Les solutions de contrôle devraient faire l’objet d’un traitement identique.

Au moment de chaque observation, il faudrait enregistrer le nombre de daphnies mortes dans chaque récipient d’essai et enlever ces daphnies. La mort est caractérisée par l’immobilité du corps, des appendices et du coeur, observés grâce à un microscope à dissection ou à un autre appareil grossissant.  Certains produits toxiques narcotiques peuvent rendre les daphnies complètement immobiles et ralentir leur rythme cardiaque pour qu’il soit de seulement un ou deux battements à la minute. Dans ce cas, le battement cardiaque devient le critère définitif de la mort.  Si l’on ne peut examiner attentivement le coeur, on devrait établir une CE50 d’inhibition de la mobilité après 48 h, de préférence à une CL50. La CE50 et ses limites de confiance se calculent de la même façon que la CL50 (section 4.5), sauf en ce qui a trait au critère différent concernant l’effet sur les daphnies.

Les comportements inhabituels devraient être enregistrés pour chaque observation. Par exemple, on devrait consigner, pour chaque solution d’essai et à chaque période d’observation, les cas d’immobilité (daphnies incapables de nager pendant les 15 secondes qui suivent une agitation légère de la solution d’essai, même si leurs antennes peuvent toujours bouger), de léthargie, de flottaison, de rotation ou de tournoiement.  Des comparaisons de comportement devraient être établies avec des organismes témoins.

Il faut mesurer la teneur en oxygène dissous, le pH et la température de chaque solution d'essai, y compris les solutions de contrôle, au moins au début et à la fin de l'essai. Les mesures finales devraient être faites une fois que l'on a terminé les observations biologiques. On doit mesurer la conductivité de chaque solution d'essai au moins au début de l'essai. De plus, on doit mesurer, avant l'exposition des daphnies, la dureté de l'eau de contrôle/de dilution et au moins de la solution d'essai de la concentration la plus élevée.

Compte tenu du faible volume des récipients d’essai, les mesures au début de l’essai peuvent être faites dans une solution d’essai «supplémentaire» préparée à cette fin. Si deux ou plusieurs récipients renferment une même concentration, on peut effectuer les mesures chimiques définitives dans un seul d’eux, ou combiner les fluides d’essai. L’oxygène dissous devrait être mesuré avant le mélange.

4.5 Résultats et calculs

On doit consigner les mortalités de daphnies dans chaque solution d’essai après 48 h d'exposition. Dans les essais à concentrations multiples, (section 4.1, 5, 6 et 7), il faut calculer la CL50 après 48 h et ses limites de confiance à 95 %, en indiquant la méthode utilisée pour ces calculs.

On peut utiliser différents programmes informatiques pour le calcul de la CL50 (ou de la CE50) et de ses limites de confiance. Stephan (1977) a mis au point un programme qui fait appel à trois méthodes (des probits, de la moyenne mobile et binomiale) et l'a adapté aux ordinateurs personnels compatibles IBM. Ce programme en BASIC est recommandé; les personnes qui fournissent une disquette peuvent se le procurer auprès d'Environnement Canada (annexe A), avec la permission de C.E. Stephan. Hubert (1987) offre aussi un programme micro- informatique efficace pour l'analyse des probits, et on peut utiliser d'autres méthodes informatiques et manuelles satisfaisantes (APHA et al., 1989; EPA, 1985a). Des programmes utilisant la méthode abrégée de Spearman-Karber (Hamilton et al., 1977) existent pour les ordinateurs personnels, mais ne sont pas recommandés ici, puisque les personnes qui ne connaissent pas les incidences de l’écrêtement des données dose-effet peuvent obtenir des résultats divergents.

Le programme de C.E. Stephan, que nous recommandons, fournit des estimations de la CL50 et des limites des confiance selon chacune des trois méthodes qu'il utilise, si l'ensemble des données comprend au moins deux cas où une partie des daphnies sont morts. Pour les données uniformes ou régulières, les trois résultats seront dans doute analogues et les valeurs de l'analyse des probits devraient être privilégiées et consignées dans le procès-verbal de l'essai. L'estimation binomiale peut différer légèrement des autres. Si les résultats ne comprennent pas deux cas où une partie des daphnies sont mortes, les méthodes des probits et de la moyenne mobile ne fonctionnent pas et la méthode binomiale peut être utilisée pour dégager la meilleure estimation possible de la CL50 (ou de la CE50) avec des limites de confiance prudentes (étendues).

On devrait vérifier toute CL50 calculée par ordinateur en examinant, sur une échelle de probabilité logarithmique, la courbe des pourcentages de (ou des pourcentages d’immobilité, si la mort n’est pas déterminée) après 48 h pour les diverses concentration d'essai Note de bas de page 18 (Figure 3,) (APHA et al., 1989).  Tout écart important entre la CL50 (ou CE50) estimée au moyen de cette courbe et celle calculée par ordinateur doit être résolu.

Pour les essais à concentration unique, les résultats dépendent de l'objectif de l'essai. Il peut s'agir : a) du pourcentage de mortalité au terme de l'exposition des poissons à l'échantillon non dilué pendant 48 h; b) du pourcentage de mortalité à différents moments, pour la comparaison de la toxicité; ou c) du temps létal de chaque poisson dans chaque solution.

Si des mesures successives sont effectuées (points b) ou c) ci-dessus), on peut estimer, si on le souhaite, le temps létal 50 (TL50) en produisant un graphique semblable à la figure 3, à ceci près que l'axe horizontal est le logarithme du temps, au lieu de la concentration. On peut estimer et comparer les limites de confiance à 95 % en prolongeant d'une étape l'analyse graphique (Litchfield, 1949). Il faut tenir compte du fait que ni le TL50 ni le pourcentage de survie à de faibles durées d'exposition ne constituent des méthodes fiables permettant de juger de la toxicité ultime; par conséquent, les comparaisons reposant sur ces résultats ne donnent que des indications semi-quantitatives.

4.6 Produits toxiques de référence

L'utilisation courante de produits toxiques de référence est nécessaire pour qu'on puisse évaluer, dans des conditions d'essai normalisées, la sensibilité relative des élevages de daphnies ainsi que la précision et la fiabilité des données obtenues en laboratoire (Environnement Canada, 1990). La sensibilité des daphnies aux produits toxiques de référence devrait être évaluée au moment de la préparation d’un nouveau lot de daphnies en vue d’un utilisation éventuelle, pendant l’essai de toxicité ou dans les 14 jours précédents ou suivants.

Voici les critères qu'on peut employer pour recommander les produits toxiques de référence convenant à cet essai :

  • facilité d'obtention du produit à l'état pur;
  • durée de conservation prolongée (stabilité);
  • solubilité élevée dans l'eau;
  • stabilité en solution aqueuse;
  • risque minimum pour l'utilisateur;
  • facilité et précision de l'analyse;
  • toxicité à une concentration relativement faible;
  • courbe dose-effet satisfaisante pour l'organisme soumis à l'essai;
  • incidence connue du pH sur la toxicité pour l’organisme soumis à l’essai;
  • influence connue de la dureté de l'eau sut la toxicité pour l'organisme soumis à l'essai.

Pour cet essai, on recommande d'utiliser comme produits toxique de référence un ou plusieurs des composés suivants de qualité «réactif» : chlorure de sodium, sulfate de zinc ou bichromate de potassium. On devrait évaluer la sensibilité des daphnies grâce à des essais statiques visant à mesurer la CL50 après 48 h pour l'un ou plusieurs de ces produits, en utilisant l'eau de contrôle/de dilution employée couramment par le laboratoireNote de bas de page 19. Les conditions de l'essai (y compris la qualité de l'eau de dilution) et les méthodes employées devraient être aussi cohérentes que possible et conformes aux principes énoncés dans le présent document.

Figure 3 Estimation d'une concentration létale 50 par la représentation graphique des mortalités (ou d’une concentration efficace 50 par la représentation des cas d’immobilité) sur papier de probabilité logarithmique.
une image d'un graphe
Description longue de la figure 3

Cette figure constitue une représentation graphique des mortalités (en pourcentages et en probités) à titre de fonction de concentration. Une ligne pleine est tracée pour cadrer avec les points de données indiqués. Une ligne pointillée s'étend horizontalement depuis le point de mortalité de 50 % sur l'axe Y jusqu'à son intersection avec la ligne pleine traçant les points de données. Une deuxième ligne pointillée descend verticalement depuis le point d'intersection jusqu'à l'axe X. Le point d'intersection entre cette ligne verticale et l'axe X représente l'estimation de la concentration létale 50 (CL50).

Dans cet exemple hypothétique, dix daphnies on été exposées à chacune de cinq concentrations. La ligne a été ajustée à l'oeilNote de bas de page 18. On peut établir la concentration qu'on prévoit être létale pour 50 % des poissons e p n suivant la ligne pointillée à partir du niveau de 50 % jusqu'à son intersection avec la ligne ajustée, puis en passant à l'axe horizontal pour une estimation de la CL50 (5,6 mg/L).

Un diagramme de contrôle devrait être établi et mis à jour pour chaque produit toxique de référence utilisé. Ce diagramme devrait rapporter la concentration logarithmique en coordonnée et la date de l'essai en abscisse. Chaque nouvelle CL50 pour le produit toxique de référence devrait être comparée aux limites d'avertissement établies; pour être acceptable, la CL50 doit s'inscrire à l'intérieur des limites. La moyenne et l'écart type doivent toujours être calculés sur une échelle logarithmique. La moyenne logarithmique et ses limites d'avertissement inférieure et supérieure (± 2 fois l'écart type) calculées en prenant les valeurs logarithmiques disponibles, sont recalculées pour chaque CL50 successive, jusqu'à ce que les statistiques se stabilisent (EPA, 1985a; Environnement Canada, 1990).

Le diagramme de contrôle peut être établi en reportant simplement la moyenne et ± 2 fois l'écart type comme logarithmes, ou si l'on préfère, en les convertissant en valeurs arithmétiques et en reportant la CL50 et ± 2 fois l'écart type sur une échelle logarithmique de concentration.

Si une CL50 s'inscrit en dehors des limites de contrôle, la sensibilité des organismes et le système d'essai sont douteux. Dans la mesure où cela peut se produire 5 % du temps du fait du hasard seulement, une CL50 qui s'inscrit en dehors de ces limites ne signifie pas nécessairement qu'il faut mettre en question la sensibilité de la population de daphnies ou la précision des données de toxicité produites par le laboratoire; il s'agit plutôt d'un avertissement que cela peut être le cas. On doit alors vérifier attentivement l’état de santé de l’élevage (section 2.4.12) ainsi que toutes les conditions d’élevage et d’essai. Selon les constatations faites, il peut s'avérer nécessaire d'entreprendre l'acclimatation d'une nouvelle population de daphnies puis de la soumettre à une évaluation (avec un ou des produits toxiques de référence) avant de l'utiliser dans les essais de toxicité.

Les concentrations des produits toxiques de référence dans toutes les solutions mères devraient être mesurées au moyen de méthodes chimiques appropriées (p. ex., APHA et al., 1989). Au moment de la préparation des solutions d'essai, on devrait prélever des aliquotes au moins dans la solution de contrôle et dans les solutions à teneur inférieure, moyenne et supérieure; ces aliquotes devraient être analysées immédiatement ou stockées pour analyse future, au cas où la CL50 serait atypique (à l'extérieur des limites de contrôle). Si elles sont stockées, on devrait les tenir à l'obscurité, à une température de 4 ± 2° C. Les solutions de zinc devraient être préservées avant d’être stockées (APHA et al., 1989). Les aliquotes stockées nécessitant une mesure chimique devraient être analysées sans délai aussitôt l’essai de toxicité terminé. Il est souhaitable de mesurer les concentrations dans les mêmes solutions à la fin de l'essai, une fois terminées les observations biologiques. Le calcul de la CL50 devrait être fondé sur les concentrations moyennes mesurées, si elles diffèrent appréciablement (c.-à-d. de plus de 20 %) des concentrations nominales et si les analyses chimiques sont exactes et faibles.

Les concentrations de chlorure de sodium devraient être exprimées en poids du sel total (NaCl) dans l’eau (g/L). Cette valeur diffère légèrement de la mesure normale de la salinité en g/kg ou en parties par millier. On devrait utiliser du sulfate de zinc (généralement de formule ZnSO4 A 7H2O et d’une masse moléculaire égale à 4,3982 fois celle du zinc) pour la préparation des solutions mères de zinc. Ces solutions devraient être acides (pH de 3 à 4), et on peut les conserver dans l’obscurité à 4 ± 2° C pendant plusieurs semaines jusqu’au moment de l’utilisation. La concentration de zinc devrait être exprimée en mg Zn++/L. Les solutions mères de bichromate de potassium devraient être conservées à l’obscurité dans des bouteilles à bouchon de verre, et leur concentration devrait s’exprimer en mg Cr +++ /L. La masse moléculaire du K2CrO7 est égale à 2,8290 fois celle du chrome.

4.7  Considérations juridiques

Les prescriptions complètes et détaillées établies pour les essais de létalité aiguë réalisé à des fins juridiques débordent le cadre du présent document. On doit absolument prendre soin de veiller à ce que les échantillons soumis à des essais soient recevables en preuve en cas d'action en justice devant un tribunal. Pour cela, les échantillons doivent : être représentatifs de la substance échantillonnée; ne pas être contaminés par des substances étrangères; avoir des coordonnées précises (date, heure et lieu d'origine); être consignés clairement pour assurer la continuité de la preuve; et être analysés le plus tôt possible après leur prélèvement. Les personnes responsables de l'exécution de l'essai et de l'établissement du procès-verbal doivent assurer la continuité de la preuve en cas d'action en justice (McCaffrey, 1979) ainsi que l'intégrité des résultats des essais.

Section 5 : Méthodes particulières pour l'essai de produits chimiques

La présente section énonce des instructions particulières pour l'essai de produits chimiques, qui viennent s'ajouter aux méthodes exposées dans la section 4.

5.1  Propriétés, étiquetage, transport et stockage des échantillons

On devrait obtenir des renseignements sur les propriétés du produit chimique à expérimenter, notamment sa solubilité dans l'eau, sa tension de vapeur, sa stabilité chimique, ses constantes de dissociation et sa biodégradabilité. Il faudrait consulter la fiche signalétique sut les marchandises dangereuses concernant ce produit, s'il en existe une. Quand la solvabilité dans l'eau d'un produit chimique soulève des doutes ou des difficultés, les méthodes admissibles utilisées antérieurement pour la préparation de solutions aqueuses de ce produit devraient être recueillies et consignées. Il faudrait également recueillir et consigner les autres renseignements existants, par exemple la formule structurelle, le degré de pureté, la nature et le pourcentage des impuretés significatives, ainsi que la présence et les quantités d'additifs.Note de bas de page 20

Dès réception des produits chimiques, les contenants doivent être fermés hermétiquement et codé ou étiquetés (p. ex., nom du produit chimique, fournisseur et date de réception). Les conditions de stockage (p. ex., température et protection contre la lumière) sont souvent dictées par la nature du produit chimique. Les modes opératoires normalisés pour la manipulation et le stockage des produits chimiques devraient être respectés.

5.2  Préparation des solutions d'essai

Dans le cas des produits chimiques, on exécute généralement un essai à concentrations multiples afin d'établir la CL50. Il peut s'avérer souhaitable de prévoir des répétitions (deux ou trois) pour chaque concentration d'essai, lorsqu'ils s'agit d'évaluer de nouveaux produits chimiques. Des répétitions peuvent s'avérer nécessaires en vertu des règlements sur l'enregistrement des pesticides et des catégories analogues de produits chimiques. Si le produit à expérimenter est volatile, il faudrait fermer les récipients d’essai et laisser le moins possible de vide d’air au-dessus des solutions.

Les récipients d’essai doivent être en verreNote de bas de page 8. On peut préparer les solutions en ajoutant des quantités prépesées (à l'aide d'une balance de précision) du produit chimique dans chaque réservoir d'essai, de façon à obtenir les teneurs nominales à expérimenterrNote de bas de page 21, ou en ajoutant des volumes mesurés d'une solution mère. On devrait préparer les solutions mères en dissolvant le produit chimique à expérimenter dans de l'eau de contrôle/de dilution. Pour les produits chimiques qui ne se dissolvent pas facilement dans l'eau, les solutions mères peuvent être préparées au moyen de la technique de la colonne génératrice (Billington et al., 1988; Shiu et al., 1988) ou, comme second choix, par dispersion ultrasonique. Cette dernier technique n’est pas nécessairement sans inconvénient; en effet, les ultrasons peuvent disperser une partie du produit chimique sous forme d’émulsion ou de fines gouttelettes, qui peuvent être absorbées sélectivement par les daphnies au cours de leurs activités de filtration. En autre, cette technique peut donner lieu à des variations de la disponibilité du produit chimique (et, par conséquent, de sa toxicité), en raison de la production de gouttelettes non uniformes et de tailles différentes. Les gouttelettes peuvent aussi remonter vers la surface au cours de l’essai.

On ne devrait pas utiliser de solvants organiques, d'émulsifiants ou de dispersants pour accroître la solubilité du produit chimique, sauf dans les cas où ces substances pourraient être formulées avec le produit en cause dans son utilisation commerciale normale. Les cas échéant, on devrait préparer une solution de contrôle supplémentaire renfermant la même concentration d'agent solubilisant que la solution la plus concentrée du produit chimique à expérimenter. Ces agents devraient être utilisés parcimonieusement, leur concentration ne devant pas dépasser 0,5 mL/L dans toute solution d'essai (EPA, 1985b). Si l'on utilise des solvants, il est préférable d'utiliser les produits suivants (EPA, 1985b) : le diméthylformamide, le triéthylèneglycol, le méthanol, l'acétone et l'éthanol.

5.3  Eau de contrôle/de dilution

Pour l’évaluation normale, au laboratoire, de la toxicité d’un produit chimique, l'eau de contrôle/de dilution peut être de l'eau reconstituée, de l'eau du laboratoire (eau souterraine ou de surface non contaminée ou eau municipale déchlorée). Si l’on doit évaluer l’effet toxique d’un produit chimique sur un milieu récepteur particulier, on pourrait prélever des échantillons de ce milieu, à l’abri de l’influence du produit, et les utiliser comme eau de contrôle/de dilutionNote de bas de page 22,Note de bas de page 23.  Par exemple, il peut s’agir d’évaluer l’effet toxique sur une nappe d’eau particulière de déversements ou d’applications intentionnelles de produit chimiques (p. ex., vaporisation d’un pesticide). Le choix de l’eau de contrôle/de dilution dépend de l’objet de l’essai.

Si un degré élevé de normalisation est nécessaire (p. ex., s’il faut calculer la toxicité d'un produit chimique dans plusieurs installations d’essai et comparer les valeurs obtenues), il faudrait utiliser de l'eau reconstituée d'une dureté particulière pour toutes les dilutions et comme eau de contrôleNote de bas de page 24. Il est recommandé d’utiliser une eau d’une dureté se situant entre 40 et 48 mg/L pour Daphnia pulex et entre 80 et 100 mg/L pour D. magna (section 2.4.9), ce qui est le plus conforme possible à ce qui se fait ailleurs (annexe B). Lorsqu’on pense que la dureté ou d’autres caractéristiques de l’eau de dilution peuvent influer sur la toxicité du produit chimique à expérimenter, on peut mener deux essais ou plus avec différentes eaux reconstituées.

5.4  Observations et mesures

Pendant la préparation des solutions et à chacune des périodes d'observation prescrites, on devrait examiner chaque solution d'essai afin d’observer la présence et l'évolution du produit chimique (p. ex., couleur et opacité de la solution, précipitation ou floculation du produit chimique). Toute observation devrait être consignée.

Il est souhaitable d'analyser les solutions d'essai afin de déterminer les concentrations de produits chimiques auxquelles les daphnies sont exposéesNote de bas de page 25. Pour le faire, on devrait prélever des échantillons dans les solutions d'essai à teneur supérieure, moyenne et inférieure et dans les solutions de contrôle, au début et à la fin de l'essai au minimum. Ces échantillons devraient être conservés, stockés et analysés au moyen des meilleures méthodes éprouvées permettant d'établir la concentration du produit chimique visé en solution aqueuse.

Si le dosage du produit chimique indique que les concentrations ont fléchi de plus de 20 % pendant l'essai, la toxicité létale aiguë du produit chimique devrait être réévaluée au cours d'un essai à renouvellement périodique (APHA et al., 1989) ou continu (EPA, 1982 et 1995b). Dans tous les essais au cours desquels on mesure les concentrations, la toxicité devrait être calculée et exprimée en fonction des concentration mesurées, sauf s'il y a de bons motifs de croire que les mesures chimiques ne sont pas exactes. Aux fins de ces calculs, on devrait caractériser chaque solution d'essai par la moyenne géométrique des concentrations mesurées auxquelles les organismes ont été exposés.

5.5 Résultats et calculs 

Le résultat des essais de produits chimiques est généralement une CL50 après 48 h. Les méthodes admises pour le calcul de la CL50 et de son intervalle de confiance à 95 % sont énoncées à la section 4.5.

L'essai n'est pas valable si la mortalité dans la solution de contrôle contenant un solvant (ou dans l'eau de contrôle non traitée) est supérieure à 10 %, ou si plus de 10 % des daphnies dans l'une ou l'autre solution ont un comportement atypique ou stressé (p. ex., immobilité).

Section 6 : Méthodes particulières pour l'essai d'échantillons, d'effluents, d'élutriats et de lixiviats

La présente section énonce des instructions particulières pour l'essai d'échantillons, d'effluents, d'élutriats et de lixiviats; ces instructions viennent s'ajouter aux méthodes exposées dans la section 4.

6.1  Étiquetage, transport et stockage des échantillons

Les contenants utilisés pour le transport et le stockage des échantillons d'effluents, de lixiviats et d'élutriats doivent être fabriqués de matériaux non toxiques (p. ex., verre, polyéthylène ou polypropylène). Ils doivent être neufs, ou encore nettoyés à fond et rincés avec de l'eau non contaminée, et ils devraient également être rincés avec l'échantillon à recueillir. Il faudrait les remplir afin de réduire les vides d’air.

Aussitôt l'échantillon recueilli, chaque contenant doit être rempli, fermé hermétiquement et étiqueté ou codé. L'étiquette devrait porter au moins le type d'échantillon, la source, la date et l'heure du prélèvement, ainsi que le nom des préposés à l'échantillonnage. Les contenants non étiquetés ou non codés livrés au laboratoire ne devraient pas être retenus pour des essais. En général, les échantillons livrés dans des contenants remplis en partie ne devraient pas non plus faire l'objet d'essais, puisque les produits toxiques volatils s'évaporent dans le vide d'air. Cependant, si l'on sait que la volatilité ne pose pas de problème, ces échantillons pourraient faire l'objet d'essais, à la discrétion de l'expérimentateur.

L'essai des échantillons d'effluents et de lixiviats devrait être entrepris le plus tôt possible après leur prélèvement. Il devrait débuter dans les trois jours et doit être entrepris au plus tard cinq jours après la fin des prélèvements. Les échantillons recueillis pour extraction et essai de l'élutriat devraient subir l'essai dans les dix jours suivant leur réception. Les élutriats devraient faire l'objet d'un essai dans les trois jours suivant la préparation de l'échantillon ou selon les instructions fournies.

Il est souhaitable de ranger au froid les échantillons d'effluents et de lixiviats aussitôt recueillis et pendant le transport. Lorsque cela est peu pratique (p. ex., s'il faut expédier de forts volumes d'échantillons), on peut les conserver à la température ambiante pendant le transport. Cependant, quand cette température est extrême (c.-à-d. supérieure à 30° C ou inférieure à 1° C) ou quand on prévoit des délais de transport supérieurs à deux jours, la température des échantillons devrait être contrôlée (de 1 à 8° C) en cours de transport.

Les échantillons d'effluents et de lixiviats ne devraient pas geler pendant le transport. À l'arrivée au laboratoire, ils peuvent être ramenés immédiatement ou pendant la nuit à 20 ± 2° C et les essais peuvent être entrepris. Si un stockage plus long s'avère nécessaire, les contenants devraient être entreposés dans l'obscurité entre 1 et 8° C et, de préférence, à 4 ± 2° C.

Sauf précision contraire, les conditions de température pendant le transport et le stockage des élutriats, ainsi que des échantillons destinés à l'extraction aqueuse et à l'essai ultérieur de l'élutriat, devraient être conformes aux indication ci-dessus.

6.2  Préparation des solutions d'essai

Les contenants d'échantillons doivent être agités vigoureusement juste avant d'être vidés, afin d'assurer la resuspension des solides décantables.  Les sous-échantillons (c.-à-d. les échantillons répartis dans deux ou plusieurs contenants) doivent être mélangés ensemble, afin d'assurer leur homogénéité. S'il est nécessaire de stocker à nouveau les échantillons, l'échantillon composite (ou une partie de cet échantillon) devrait être retourné dans les contenants de sous-échantillons et stocké (section 6.1) jusqu'au moment de l'utilisation.

Au besoin, on peut ajuster la température des échantillons ou des solutions d'essai à la température précisée pour l'essai. Pour chauffer les échantillons ou les solutions d'essai, utiliser un bain-marie. Ne pas utiliser de thermoplongeur étant donné que cela peut altérer les constituants chimiques et modifier la toxicité. Pour le refroidissement, utiliser un bain d'eau glacée ou un refroidisseur à immersion fait d'un matériau non toxique (p. ex., acier inoxydable). Chaque essai, que ce soit avec des concentrations multiples ou une concentration unique, doit comprendre une ou plusieurs solutions de contrôle.

6.3  Eau de contrôle/de dilution

Pour les essais de surveillance et de conformité réalisés sur des échantillons d'effluents ou de lixiviats, on devrait utiliser comme eau de contrôle/de dilution l'eau naturelle ou reconstituée dans laquelle les daphnies ont été élevées, ou un échantillon de milieu récepteurNote de bas de page 22,Note de bas de page 23. Étant donné que les résultats pourraient s’avérer très différents pour les deux source d'eau, on doit fixer les objectifs de l'essai avant d'effectuer ce choix. Il faudrait également tenir compte des difficultés et des coûts de transport, puisque l'utilisation du milieu récepteur comme eau de contrôle/de dilution augmente considérablement le volume de liquide à transporter.

L'utilisation du milieu récepteur comme eau de contrôle/de dilution peut être souhaitable dans certains cas, lorsqu'il faut recueillir des renseignements propres au site visé en ce qui concerne l'effet toxique potentiel d'un effluent, d'un lixiviat ou d'un élutriat sur un milieu récepteur particulier Note de bas de page 22,Note de bas de page 23. Les conditions de prélèvement, de transport et de stockage des échantillons de milieux récepteurs devraient être conformes aux dispositions de la section 6.1.

Si un échantillon de milieu récepteur prélevé en amont doit être utilisé comme eau de contrôle/de dilution, une solution de contrôle distincte devrait être préparée à partir de l'eau du laboratoire à laquelle les daphnies ont été élevées pendant deux ou plusieurs semaines. La survie, l'aspect et le comportement des daphnies (section 4.4) dans l'eau de contrôle du laboratoire devraient être comparés à ceux des poissons dans l'échantillon de milieu récepteurNote de bas de page 26

Les essais nécessitant un degré supérieur de normalisation peuvent faire appel à de l'eau reconstituée d’une dureté particulière (tableau 2) comme eau de contrôle/de dilutionNote de bas de page 24. Cette eau peut convenir lorsqu'il faut évaluer la toxicité d'un échantillon ou d'une série d'échantillons en comparant les résultats obtenus à un certain nombre de laboratoires ou à un même laboratoire où la qualité de l'eau est variable. L’utilisation d’eau reconstituée permet alors de minimiser toute influence modificatrice attribuable à des différences dans la chimie de l'eau de dilution.

6.4  Observations et mesure

La couleur, la turbidité, l’odeur et l’homogénéité (c.-à-d. la présence de matières flottantes ou de solides de l’échantillon d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat devraient être observées au moment de la préparation des solutions d’essai. La précipitation, la floculation, le changement de couleur, le rejet de matières volatiles ou d’autres réactions au moment de la dilution avec l’eau devraient être consignés, tout comme les changements d’aspect des solutions pendant l’essai (p. ex., le moussage, la décantation, la floculation, l’augmentation ou la diminution de la turbidité et les variations de couleur).

Lorsque les échantillons d’effluent ont une teneur en solides appréciable, il est souhaitable de mesurer leur totale en solides en suspension et décantables (APHA et al., 1989) dès leur réception; ces éléments, qui font partie de la description générale de l’effluent, peuvent influer sur les résultats de l’essai de toxicité.

6.5  Résultats et calculs

Les essais de surveillance et de conformité devraient normalement porter, au minimum, sur une ou plusieurs parties non diluées de l'échantillon et sur une ou plusieurs solutions de contrôle. Selon les exigences réglementaires précisées, les essais de conformité peuvent faire appel à une seule concentration (100 % d'eaux usées, sauf indication contraire) ou déterminer la CL50 après 48 h (section 4.5).

Les essais réalisés pour la surveillance de la toxicité des effluents, des lixiviats ou des élutriats peuvent viser à mesurer le pourcentage de mortalité des organismes après 48 h dans une seule concentration, à établir le TL50 de l'échantillon, dilué ou non, ou encore à mesurer la CL50 après 48 h. Le résultat dépend d'un certain nombre de considérations, notamment les objectifs du programme de surveillance, les exigences de conformité, le coût des essais et les antécédents en matière de survie de daphnies dans des eaux usées non diluées.

Les essais de toxicité réalisés à d'autres fins (p. ex., détermination de sources de toxicité à l'intérieur d'une usine, de l'efficacité d'un traitement ou des effets de modifications d'un procédé sur la toxicité) peuvent, selon les objectifs de l'étude, porter sur une seule concentration (100 % ou une dilution appropriée, ainsi qu'un contrôle) ou sur des concentrations multiples. Les essais à concentration unique sont souvent un moyen économique d'établir la présence ou l'absence d'une toxicité létale aiguë ou d'évaluer un nombre important d'échantillons afin d'établir leur toxicité relative. Les résultats de ces essais dépendent toujours des objectifs de l'étude; il peut s'agir de cotes arbitraires de réussite ou d'échec, d'un pourcentage de mortalité de daphnies après 48 h ou dans un délai plus rapproché (p. ex., 24 h), ou du temps létal de chaque daphnie dans chaque solution. Les éléments exposés à la section 4.5 sont pertinents dans ce cas.

Section 7 : Méthodes particulières pour l’essai d’échantillons de milieux récepteurs

Le lecteur trouvera ci-après des instructions pour l'essai d'échantillons de milieux récepteurs, qui viennent s'ajouter aux méthodes exposées dans la section 4.

7.1  Étiquetage, transport et stockage des échantillons

Les méthodes d'étiquetage, de transport et de stockage des échantillons devraient être conformes aux dispositions de la section 6.1. Les essais devraient être mis en route le plus tôt possible après le prélèvement des échantillons; ils devraient débuter dans les trois jours et doivent être entrepris au plus tard cinq jours après la fin des prélèvements.

7.2  Préparation des solutions d'essai

Les contenants devraient être agités avant d'être vidés, afin d'assurer l'homogénéité des échantillons. Les sous-échantillons devraient être composés comme le prévoit la section 6.2.

7.3  Eau de contrôle/de dilution

Pour les échantillons de milieux récepteurs recueillis dans le voisinage d'un point de rejet d'eaux usées, d'un déversement de produits chimiques ou d'une autre source ponctuelle de contamination possible, on pourrait prélever simultanément de l'eau d'amont et l'utiliser comme eau de contrôle/de dilution pour les échantillons d'avalNote de bas de page 22,Note de bas de page 23. Cette eau devrait être prélevée le plus près possible des sources de contamination en cause, mais en amont ou à l'extérieur de leur zone d'influence.

Si l'on utilise de l'eau d'amont comme eau de contrôle/de dilution, on devrait préparer une solution de contrôle distincte à partir de l'eau du laboratoire à laquelle les daphnies ont été acclimatées pendant deux ou plusieurs semaines. La survie et le comportement des daphnies (section 4.4) dans l'eau de contrôle du laboratoire devraient être comparés à ceux des daphnies détenues dans des conditions analogues dans l'eau de contrôle d'amontFootnote 26.  Si ces dernières montrent des signes d'épuisement ou de mortalité et si l'on prépare des dilutions de l'eau d'aval pour les essais (parce que l'on s'attend à ce qu'elle soit toxique), on devrait préparer à ce moment un ensemble distinct de dilutions au moyen de l'eau du laboratoire dans laquelle les daphnies ont été élevées. Les expérimentateurs prévoyant cette éventualité devraient recueillir des volumes suffisants d'échantillons pour permettre de préparer ces dilutions supplémentaires.

Des contraintes logistiques, les effets toxiques prévus ou d'autres détails pratiques propres à l'emplacement peuvent empêcher l'utilisation de l'eau d'amont comme eau de contrôle/de dilution. En pareil cas, l'eau du laboratoire utilisée pour l'élevage des daphnies devrait servir à cette fin. On pourrait corriger certaines de ses caractéristiques afin de simuler en partie l'eau d'amontNote de bas de page 23.

7.4  Observations et mesures

La couleur, la turbidité, le moussage, la précipitation et les autres caractéristiques de l'échantillon et des solutions devraient être observés conformément aux dispositions de la section 6.4, aussi bien pendant la préparation des solutions d'essai que par la suite, pendant les essais eux-mêmes. Ces observations viennent s'ajouter aux observations de base sur les organismes prévues à la section 4.4.

7.5  Résultats et calculs

Les résultats des essais portant sur des échantillons de milieux récepteurs devraient être conformes aux options et aux démarches prévues dans les sections 4.5 et 6.5.

Les essais de surveillance et de conformité devraient normalement porter, au minimum, sur une ou plusieurs parties non diluées d'un échantillon et sur une ou plusieurs solutions de contrôle. Les résultats des essais d'échantillons de milieux récepteurs peuvent être limités à l'établissement d'un pourcentage de mortalité des daphnies après 48 h dans l'échantillon non dilué, ainsi qu'aux données sur le temps létal, le cas échéant. Lorsque les échantillons de milieux récepteurs sont probablement toxiques et que l'on souhaite obtenir des renseignements sur le degré de dilution nécessaire pour permettre la survie à court terme des daphnies, on devrait effectuer un essai permettant d'établir la CL50 après 48 h. Une ou plusieurs concentrations non diluées (échantillon à 100 %) et au moins quatre dilutions devraient faire l'objet de cet essai, ainsi qu’une ou de plusieurs solutions de contrôle. En supposant que les données le permettent, la CL50 et ses limites de confiance à 95 % devraient être calculées.

Section 8 : Procès-verbal de l'essai

Le procès-verbal de l'essai devrait décrire les matériaux et les méthodes utilisés, ainsi que les résultats de l'essai. À partir de ce document, le lecteur devrait être en mesure de savoir si, compte tenu des conditions et des méthodes utilisées, les résultats sont admissibles pour l'utilisation prévue.

Les méthodes et conditions communes à une série continue d'essais (p. ex., essais de toxicité courants à des fins de surveillance ou de conformité) et conformes aux dispositions du présent document peuvent faire l'objet d'un renvoi à un procès-verbal général définissant le mode opératoire normalisé. Les sections 8.1 à 8.7 inclusivement énumèrent diverses exigences (identifiées dans le présent rapport par des boulets) à consigner dans les procès-verbaux. Les renseignements particuliers à un essai doivent être inclus dans le procès-verbal propre à l'essai. Les renseignements méthodologiques inhérents aux pratiques de laboratoire normalisées utilisées lors de l'application de cette méthode d'essai biologique peuvent figurer dans le procès-verbal général.

Chaque rapport particulier à un essai doit indiquer tout non respect des exigences précisées aux sections 2 à 7 de la présente méthode d'essai biologique et, le cas échéant, en préciser les détails. Des programmes de surveillance particuliers ou des protocoles relatifs aux essais (p. ex., le mode opératoire et les résultats des essais exigeant une correction du pH et (ou) de la dureté) pourraient exiger la mention de certains éléments dans le procès-verbal propre à l'essai ou encore demander à ce que certains renseignements méthodologiques portent la mention «Données à garder en dossier». Les détails concernant la réalisation et les résultats de l'essai qui ne sont pas consignés au procès-verbal devraient être versés aux dossiers du laboratoire d'essai, de sorte qu'on puisse obtenir les renseignements voulus si une vérification de l'essai s'avère nécessaire.

8.1  Substance à expérimenter

  • Type, source et description de l’échantillon (produit chimique, effluent, élutriat, lixiviat ou milieu récepteur; lieu et méthode de prélèvement; détails sur la nature, l'aspect et les propriétés de l'échantillon, ainsi que son volume ou son poids).
  • Renseignements sur l'étiquetage ou le codage de la substance à expérimenter.
  • Détails sur le modalités de prélèvement, de transport et de stockage des échantillons (p. ex., échantillon instantané, discontinu ou composite, description du contenant, et température de l'échantillon à la réception et pendant le stockage).
  • Identité des personnes ayant prélevé au fourni l’échantillon.
  • Date et heure du prélèvement de l’échantillon, de sa réception à l'installation d'essai et du début de l'essai définitif.

8.2 Organismes soumis à l'essai

  • Espèce et source.
  • Descriptions des conditions et des méthodes d’élevage ; installations, éclairement, source et qualité de l'eau, prétraitement de l'eau, conditions et appareils d’aération, méthodes d’élevage (y compris la fréquence et le mode d’échange de l’eau), méthodes de manipulation des organismes, température pendant l’élevage, type de nourriture, ration et fréquence d'alimentation.
  • Pourcentage estimatif de mortalité dans l’élevage pendant les sept jours précédant l’essai.
  • Données sur l’âge de daphnies au moment de leur première couvée et sur le nombre moyen de néonates par couvée.
  • Mode opératoire et méthodes employées pour obtenir des néonates des génitrices.
  • Âge des organismes au début de l’essai.

8.3  Installations et appareils

  • Nom et adresse du laboratoire d’essai.
  • Nom des personnes ayant effectué l'essai.
  • Description des systèmes de réglage de l'éclairement et de la température dans l'installation d'essai.
  • Description des récipients d'essai (taille, forme et type de matériau).

8.4  Eau de contrôle/de dilution

  • Type et source(s) de l'eau utilisées comme eau de contrôle/de dilution.
  • Type et quantité de tout produit chimique ajouté à l'eau de contrôle/de dilution.
  • Détails sur l'échantillonnage et le stockage, si l'eau de contrôle/de dilution provient du milieu récepteur en amont.
  • Prétraitement de l'eau (correction de la température, de la dureté ou du pH, dégazage, débit et durée d'aération, etc.)
  • Variables de la qualité de l'eau mesurées avant l'essai et au début de l'essai.

8.5  Méthode d'essai

  • Brève mention de la méthode utilisée, s'il s'agit d'une méthode normalisée (p. ex., conforme au présent document).
  • Conception et description de la méthode, si elle spécialisée (p. ex., renouvellement périodique ou continu des solutions d'essai), ou des modifications apportées à la méthodes normalisée.
  • Méthode utilisée pour la préparation des solution mères et des solutions d'essai de produits chimiques.
  • Résultats de toute analyse chimique des solutions d'essai et mention des méthodes analytiques utilisées.
  • Utilisation d'un essai préalable ou de détermination de l'ordre de grandeur.
  • Fréquence et nature des observations effectuées pendant l'essai.

8.6  Conditions de l'essai

  • Nombre, concentration, volume et profondeur des solutions d'essai, y compris les solutions de contrôle.
  • Nombre d’organismes par solution d’essai et par volume de 10 mL.
  • Photopériode, source lumineuse et éclairement à la surface des solutions d'essai.
  • Renseignements sur l'aération des échantillons ou des solutions d'essai (débit, durée et mode d'application) avant l'exposition des daphnies.
  • Description de toute correction du pH ou de la dureté des solutions d'essai, y compris la méthode employée et le moment de la correction.
  • Résultats de toute mesure chimique des solutions d'essai (p. ex., concentration du produit chimique et teneur en solides en suspension).
  • Température, pH, oxygène dissous (mg/L et pourcentage de saturation) et conductivité, d'après les mesures et les observations faites dans chaque solution d'essai.
  • Conditions et méthodes de mesure de la CL50 après 48 h ou des produits toxiques de référence.

8.7  Résultats de l'essai

  • Aspect des solutions d'essai et modifications constatées pendant l'essai.
  • Comportement des daphnies, et nombre et pourcentage des daphnies mortes ou immobiles dans chaque solution d'essai (y compris la solution de contrôle), selon les données consignées au cours de chaque période d'observation. Nombre et pourcentage des organismes témoins ayant un comportement atypique ou stressé.
  • Résultats de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur (s'il y en a eu un).
  • Toute valeur CL50 ou TL50 après 48 h (y compris les limites de confiance à 95 %) ayant été établie, y compris une mention de la méthode statistique utilisée pour les calculs.
  • CL50 après 48 h et limites de confiance à 95 % établies pour le ou les produits toxiques de référence, à 14 jours ou moins de l'essai, au moyen de l’élevage dont proviennent les daphnies utilisées pour l'essai; valeur moyenne (± 2 fois l'écart type) obtenue pour le ou les mêmes produits à l'installation d'essai au cours d'essais antérieurs.

Références

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Annexe A

Membres du Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique et adresses de l’administration centrale et des bureaux régionaux d’Environnement Canada

Membres du Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique (au mois de juillet 1990)

Gouvernement fédéral (Environnement Canada)

P. Wells (président actuel)
PE, Dartmouth (N.-É.)

B. Moores
St. John’s (T.-N.)

K. Doe
Dartmouth (N.-É.)

W. Parker
Dartmouth (N.-É.)

N. Bermingham
Longueuil (Québec)

C. Blaise
Longueuil (Québec)

G. Elliot
Edmonton (Alberta)

R. Watts
North Vancouver (C.-B.)

K. Day
Institut national de recherche sur les eaux
Burlington (Ontario)

B. Dutka
Institut national de recherche sur les eaux
Burlington (Ontario)

C. Kriz
Direction des programmes fédéraux
Ottawa (Ontario)

D. MacGregor
Direction des produits chimiques commerciaux
Ottawa (Ontario)

P. MacQuarrie
Direction des produits chimiques commerciaux
Ottawa (Ontario)

R. Scroggins
Direction des programmes industriels
Ottawa (Ontario)

G. Sergy
Direction du développement technologique
Edmonton (Alberta)

P. Farrington
Direction de la qualité des eaux
Ottawa (Ontario)

Gouvernements provinciaux

C. Bastien
Ministère de l’Environnement du Québec
Ste-Foy (Québec)

G. Westlake
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Rexdale (Ontario)

W. Young
Ministère de l’Environnement et de la Sécurité
publique du Manitoba
Winnipeg (Manitoba)

K. Lauten
Ministère de l’Environnement et de la Sécurité
publique de la Saskatchewan
Regina (Saskatchewan)

J. Somers
Ministère de l’Environnement de l’Alberta
Vegreville (Alberta)

S. Horvath
Ministère de l’Environnement et de la Colombie-
Britannique
Vancouver (C.-B.)

G. van Aggelen
Ministère de l’Environnement et de la Colombie-
Britannique
Vancouver (C.-B.)

Adresses de l’administration centrale et des bureaux régionaux
d’Environnement Canada

Administration centrale
351, boulevard Saint-Joseph
Place Vincent-Massey
Hull (Québec)
K1A 0H3

Région de l’Atlantique
15e étage, Queen Square
45, promenade Alderney
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)
B2Y 2N6

Région du Québec
105 rue McGill
8e étage
Montréal (Québec)
H2Y 2E7

Région de l’Ontario
4905 rue Dufferin
2e étage
Downsview (Ontario)
M3H 5T4

Région des Prairies et du Nord
Twin Atria No. 2, pièce 210
4999-98e avenue
Edmonton (Alberta)
T6B 2X3

Région du Pacifique et du YukonNote de bas de page 27
224, rue Esplanade ouest
North Vancouver (Colombie-Britannique)
V7M 3H7

Annexe B

Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp.Note de bas de page 28

Tableau 4a Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Type de substance à expérimenter)
Document Type de Substance
APHA et al., 1985 effluent
ISO, 1982 effluent ou autre substance soluble
ASTM, 1984 effluent
OCDE, 1981 produit chimique
EPA, 1982 produit chimique
Plotkin et Ram, 1983 produit chimique ou effluent
Pays-Bas, 1980 produit chimique ou effluent
BHSC, 1982 produit chimique
EPA, 1985b produit chimique
Greene et al., 1988 élutriat ou milieu récepteur
C.-B., 1988 effluent
Poirier et al., 1988 effluent
Tableau 4b Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Organisme, type d'essai et durée)
Document Organisme Cycle biologique (h) Type d'essai Durée
APHA et al., 1985 D. magna néonate (<24) SNote de bas de page du tableau a.3 120
ISO, 1982 D. magna néonate (6-24) S 24
ASTM, 1984 D. magna/D. pulex néonate (<24) S 48
OCDE, 1981 Daphnia sp. néonate (<24) S 24
EPA, 1982 D. magna/pulex néonate (≤24) S, RCNote de bas de page du tableau b.2 48
Plotkin et Ram, 1983 D. magna/pulex néonate (<24) S 48
Pays-Bas, 1980 D. magna néonate (<24) S 48
BHSC, 1982 D. magna/pulex néonate (6-24) S 48
EPA, 1985b D. magna/pulex néonate (<24) S, RC 48
Greene et al., 1988 D. magna/pulex néonate (2-24) S 48
C.-B., 1988 D. magna/pulex néonate (<48) S 48
Poirier et al., 1988 D. magna néonate (≤24) S 48
Tableau 4c Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Conditions d’élevage et d’acclimatation)
Document Source d’eau Température (°C) Dureté Aération
APHA et al., 1985 ERNote de bas de page du tableau a.4ENNote de bas de page du tableau b.3MRNote de bas de page du tableau c.2 20 NINote de bas de page du tableau e aucune
ISO, 1982 EN EDNote de bas de page du tableau d 20 ± 2 NI aucune
ASTM, 1984 MR 20 ± 4 NI au besoin, si OD ≥40 %
OCDE, 1981 ER EN 19 ± 1 NI pendant l’élevage au
EPA, 1982 ER EN ED MR 20 ± 1 NI besoin, si OD ≥60 %
Plotkin et Ram, 1983 ER EN 21 ± 2 NI aération légère
Pays-Bas, 1980 ER 19 ± 1 NI pendant l’élevage
BHSC, 1982 ER EN NI NI NI
EPA, 1985b NI NI NI NI
Greene et al., 1988 ER 22 ± 4 D. magna: 80-100
D. pulex: 40-48
aération légère au besoin, si OD ≥6 mg/L
C.-B., 1988 ER EN NI D. magna: 110
D. pulex:50
NI
Poirier et al., 1988 ED ou autre 20 ± 1 120-250 aération légère
Tableau 4d Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Conditions d'éclairement pendant l'élevage)
Document Photopériode (lumière : obscurité) Intensité (lux) Type d'éclairage Aube/crépuscule (min.)
APHA et al. 1985 NI NI NI NI
ISO, 1982 NI NI NI NI
ASTM, 1984 16 h : 8 h ≤ 800 fluorescent à spectre continu NI
OCDE, 1981 8 h : 16 h NI NI NI
EPA, 1982 16 h : 8 h NI NI 15 - 30
Plotkin et Ram, 1983 12 h : 12 h lumière ambiante du laboratoire NI NI
Pays-Bas, 1980 8 h : 16 h NI NI NI
BHSC, 1982 NI NI NI NI
EPA, 1985b NI NI NI NI
Greene et al., 1988 16 h : 8 h 540-1080 NI NI
C.-B., 1988 14 h : 10 h ou éclairage naturel NI NI NI
Poirier et al., 1988 16 h : 8 h ≤ 800 fluorescent
Blanc froid
NI
Tableau 4e Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Conditions d’alimentation pendant l’élevage et l’essai)
Document Alimentation pendant l’élevage Alimentation pendant l’essai
APHA et al., 1985 fumier + levure, algues ou herbe non
ISO, 1982 extrait de viande + glucose ou algues NI
ASTM, 1984 aliments naturels ou artificiels non
OCDE, 1981 algues (Chlorella spp.) non
EPA, 1982 algues ou autre aliments non
Plotkin et Ram, 1983 moulée de truite + levure oui (ajoutée à la solution)
Pays-Bas, 1980 algues (Chlorella spp.) non
BHSC, 1982 NI non
EPA, 1985b NI NI
Greene et al., 1988 moulée de truite, luzerne, levure + algues non
C.-B., 1988 moulée de truite, levure + algues non
Poirier et al., 1988 culture d’algues mélanges non
Tableau 4f Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Conditions de l’essai)
Document Récipient Volume d’essai (mL) Nombre de daphnies par récipient mL de solution par daphnie Nombre de répétitions
APHA et al., 1985 béchera de 125 mL 100 10 10 3
ISO, 1982 bécher/éprouvette NI ≤20 ≥ 2 NI
ASTM, 1984 bécher de 250 mL 200 5 40 4
OCDE, 1981 NI NI 5 2 4
EPA, 1982 bécher de 250 mL 200 10 ≥ 25 ≥ 2
Plotkin et Ram, 1983 bécher de 1 L 200 à 400 10 20 à 40 2
Pays-Bas, 1980 bécher de 0,25 ou 1L 250 à 1000 25 10 à 40 2
BHSC, 1982 NI NI 5 2 4
EPA, 1985b bécher de 250 mL 200 10 20 2
Greene et al., 1988 bécher de 100 mL 50 10 5 3
C.-B., 1988 sacs Whirl-PakMCjetables NI 10 10 2
Poirier et al., 1988 éprouvettes de 25 mm sur 100 mm 50 3 15 1
Tableau 4g Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Caractéristique de l'eau de contrôle/de dilution)
Document Type d'eau Dureté (mg/L) pH OD minimum
APHA et al, 1985 ERNote de bas de page du tableaua.5ENNote de bas de page du tableau b.4MRNote de bas de page du tableaud.1 NI NI NI
ISO, 1982 ER 250 ± 25 7,8 ± 0,2 > 80 %
ASTM, 1984 ER EN MR NI NI NI
OCDE, 1981 ER EN NI NI > 80 %
EPA, 1982 ER EN EDNote de bas de page du tableau c.3 MR NI NI ≥ 90 %
Plotkin et Ram, 1983 ER EN 170 ± 10 NI NI (aérée)
Pays-Bas, 1980 ER NI NI 100 %
BHSC, 1982 ER EN NI NI NI
EPA, 1985b ER EN 40-48 NI NI
Greene et al., 1988 ER D. magna: 80-100
D. pulex: 40-48
NI ≥ 60 %
C.-B., 1988 ER EN D. magna: 100
D. pulex: 50
NI ≥ 90 %
Poirier et al., 1988 ED ou autre 120-150 6,5-8,5 NI
Tableau 4h Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Conditions d’éclairement pendant l’essai)
Document Photopériode (lumière:obscurité) Intensité (lux) Type d’éclairage Aube/crépuscule (min.)
APHA et al., 1985 NI NI NI NI
ISO, 1982 24 h d’obscurité - - -
ASTM, 1984 16 h : 8 h ≤ 800 fluorescent à spectre continu NI
OCDE, 1981 24 h d’obscurité - - -
EPA, 1982 16 h : 8 h NI NI 15-30
Plotkin et Ram, 1983 12 h : 12 h 540-1080 NI NI
Pays-Bas, 1980 10 h : 14 h NI NI NI
BHSC, 1982 au choix NI NI NI
EPA, 1985b 16 h : 8 h NI NI 15-30
Greene et al., 1988 16 h : 8 h 540-1080 NI NI
C.-B., 1988 14 h : 10 h NI NI NI
Poirier et al., 1988 16 h : 8 h ≤ 800 fluorescent blanc froid NI
Tableau 4i Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Température, aeration, et oxygène dissous pendant l’essai)
Document Température de l’eau (° C) Aération OD minimum
APHA et al., 1985 20 aucune NI
ISO, 1982 20 ± 2 NI ≥ 2 mg/L
ASTM, 1984 20 ± 2 aucune NI
OCDE, 1981 18 - 22 (± 5) aucune > 70 %
EPA, 1982 20 ± 1 aucune ≥ 60 %
Plotkin et Ram, 1983 16 - 25 légère si OD <40 % ≥ 40 %
Pays-Bas, 1980 19 ± 1 aucune ≥ 80 %
BHSC, 1982 18-22 (± 1,0) aucune ≥ 2 mg/L
EPA, 1985b 20 NI ≥ 60 %
Greene et al., 1988 20 ± 2 aucune NI
C.-B., 1988 20 ± 2 aucune NI
Poirier et al., 1988 20 ± 1 NI NI
Table 4j Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Correction du pH avant l'essai)
Document Traitement précisé pour le pH
APHA et al., 1985 NI
ISO, 1982 NI
ASTM, 1984 NI
OCDE, 1981 ne pas corriger
EPA, 1982 NI
Plotkin et Ram, 1983 ramener le pH à 7,0 s’il est inférieur à 6,0 ou supérieur à 8,0
Pays-Bas, 1980 ramener le pH à la valeur de l’eau de contrôle si on le souhaite
BHSC, 1982 ne pas corriger le pH; reprendre l’essai au pH de l’eau de dilution
EPA, 1985b NI
Greene et al., 1988 effectuer un essai parallèle avec correction si le pH est inférieur à
ou supérieur à 10
C.-B., 1988 NI
Poirier et al., 1988 si on le souhaite, effectuer un essai supplémentaire avec correction
Tableau 4k Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Observations biologiques pendant l’essai)
Document Variable Temps (h)
APHA et al., 1985 mobilité 1 2 4 8 16 chaque jour
ISO, 1982 mobilité 24
ASTM, 1984 mort ou mobilité 24 48
OCDE, 1981 mobilité 24
EPA, 1982 mobilité 3 6 12 24 48
Plotkin et Ram, 1983 mort 1 2 4 8 12 24 48
Pays-Bas, 1980 mort 3 6 24 48
BHSC, 1982 mobilité 24
EPA, 1985b mort ou mobilité 48
Greene et al., 1988 mort, léthargie, flottaison 24 48
C.-B., 1988 mort 24 48
Poirier et al., 1988 mort, mobilité, rotation, flottaison 1 2 4 24 48
Table 4l Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphniaspp. (Surveillance de la qualité de l’eau pendant l’essai)
Document Variable Fréquence
APHA et al., 1985 NI NI
ISO, 1982 ODNote de bas de page du tableaua.6 0 24
ASTM, 1984 OD pH TNote de bas de page du tableau b.5 CNote de bas de page du tableauc.4DTNote de bas de page du tableau d.2SSNote de bas de page du tableau e.1ATNote de bas de page du tableauf 0 4 8 24 48
OECD 1981 OD pH T 0 24
EPA, 1982 OD pH T 0 24 48
Plotkin et Ram, 1983 OD 1 2 4 8 12 24 48
Pays-Bas, 1980 OD pH 0 48
BHSC, 1982 OD pH 0 24
EPA, 1985b OD pH T 0 48
Greene et al., 1988 OD pH T C DT AT 0 24 48
C.-B., 1988 OD pH 0 48
Poirier et al., 1988 OD pH C DT 0 48
Tableau 4m Écarts de méthodologie pour l'exécution d'essais de létalité aiguë sur Daphnia spp. (Résultat de l’essai)
Document Résultat Durée d’exposition (h)
APHA et al., 1985 EC50 NI
ISO, 1982 EC50 24
ASTM, 1984 EC50 ou LC50 24 et 48
OCDE, 1981 EC50 24
EPA, 1982 EC50 24 et 48
Plotkin et Ram, 1983 LC50 48
Pays-Bas, 1980 LC50 48
BHSC, 1982 EC50 24
EPA, 1985b EC50 ou LC50 48
Greene et al., 1988 LC50 48
C.-B., 1988 LC50 ou LT50 ≤ 48
Poirier et al., 1988 EC50 ou LC50 48

Annexe C

Méthode de préparation de l’YCT et de la nourriture à base d’algues pour les élevages de daphniesNote de bas de page du tableau29

Préparation de moulée de truite digérée

  1. La préparation de la moulée de truite nécessite une semaine. Utiliser des roulettes de purée de truite «de première» (starter) ou de catégorie no 1.
  2. Ajouter 5,0 g de boulettes de purée de truite à 1 L d’eau désionisée (Milli-QMC ou l’équivalent). Bien combiner dans un mélangeur et verser dans un appareil à décantation de 2L. Faire digérer avant l’utilisation en assurant une aération continue à parti du fond du contenant pendant une semaine, à la température ambiante du laboratoire. L’eau perdue par évaporation devrait être remplacée pendant la digestion. En raison de l’odeur nauséabonde qui se dégage généralement pendant la digestion, le réservoir devrait être déposé dans une hotte ou un autre endroit isolé et bien aéré.
  3. À la fin de la période de digestion, déposer la moulée dans un réfrigérateur et la laisser décanter pendant au moins 1 h. Filtrer le surnageant grâce à un tamis à mailles fines (p. ex., NitexMC, 110 mesh). Combiner des volumes égaux de surnageant des préparations de CerophyllMC et de levure (voir ci-dessous). On peut utiliser le surnageant à l’état frais ou le congeler jusqu’au moment de son utilisation. Jeter les sédiments.

Préparation de levure

  1. Ajouter 5,0 g de levure sèche, par exemple de marque Fleischmann’sMC, à 1 L d’eau désionisée.
  2. Remuer avec un agitateur magnétique, secouer vigoureusement à la main ou combiner dans un mélangeur à vitesse faible, jusqu’à ce que la levure soit bien dispersée.
  3. Combiner immédiatement la levure en suspension (ne pas la laisser décanter) avec des volumes égaux de surnageant de préparations de moulée de truite (voir cidessous) et de Cerophyll (voir ci-dessous). Jeter les quantités inutilisées.

Préparation de Cerophyll (feuilles de céréales séchées en poudre)

  1. Déposer dans un mélanger 5,0 g de feuilles de céréales séchées en poudreNote de bas de page du tableau 30. Les feuilles de luzerne séchées en poudre qu’on peut se procurer dans les magasins d’aliments naturels représentent, d’après l’expérience, un substitut satisfaisant.
  2. Ajouter 1 L d’eau désionisée.
  3. Mélanger à grande vitesse pendant 5 minutes ou agiter pendant la nuit à vitesse moyenne sur une plaque à agitateur magnétique.
  4. Si l’on utilise un mélangeur pour suspendre la substance, déposer le mélange dans un réfrigérateur pendant la nuit pour le laissez décanter. Si l’on utilise un agitateur magnétique, laisser le mélange décanter pendant 1 h. Décanter le surnageant et le combiner avec des volumes égaux de surnageant des préparations de moulée de truite et de levure. Jeter les quantités inutilisées.

Préparation de l’YCT combinée

  1. Mélanger des volumes égaux (environ 300 mL) des trois aliments décrits ci-dessus.
  2. Placer des aliquotes du mélange dans de petites bouteilles de plastique à bouchon vissé (de 50 à 100 mL) et faire congeler jusqu’à utilisation.
  3. On peut utiliser immédiatement les aliments fraîchement préparés; on peut aussi les congeler jusqu’à ce qu’on en ait besoin. Les aliments dégelés doivent être conservés au réfrigérateur entre les utilisations, pendant une durée maximal de deux semaines.

Préparation de la nourriture à base d’algues (Selenastrum)

  1. Milieu de culture des algues
    1. Préparer cinq solutions nutritives mères à partir des produits chimiques de qualité «réactif» énumérés au tableau C1.
    2. Ajouter 1 mL de chaque solution mère, selon l’ordre indiqué au tableau C1, à environ 900 mL d’eau désionisée. Bien mélanger après chaque addition. Compléter à 1 L, bien mélanger et corriger le pH pour qu’il s’établisse à 7,5 ± 0,1, au moyen d’une solution décinormale de NaOH ou de HCl, selon le cas. La concentration définitive de macronutriments et de micronutriments dans le milieu de culture est indiquée au tableau C2.
    3. Filtrer immédiatement le milieu à pH corrigé à l’aide d’une membrane dont le diamètre des pores est égal à 0,45 μm, sous un vide d’au plus 380 mm de mercure ou à une pression d’au plus une demi-atmosphère. Laver le filtre avec 500 mL d’eau désionisée avant de l’utiliser.
    4. Si la filtration est effectuée au moyen d’un appareil stérile, le milieu filtré peut être utilisé immédiatement et aucune autre mesure de stérilisation n’est nécessaire avant son inoculation. Le milieu peut également être stérilisé à l’autoclave après avoir été déposé dans les réservoirs de culture.
    5. Le milieu stérile inutilisé ne doit pas être stocké pendant plus d’une semaine avant d’être utilisé, en raison de la possibilité de pertes d’eau considérables par évaporation.
  2. Création et maintien de cultures mères d’algues
    1. Sur réception de la culture «de lancement» (généralement, environ 10 mL), on crée une culture mère en transférant aseptiquement 1 mL dans chacun de plusieurs flacons de culture de 250 mL renfermant 100 mL de milieu de culture d’algues (préparé selon la description ci-dessous). Le reste de la culture de lancement peut être mis en réserve pour une durée pouvant atteindre six mois dans un réfrigérateur (dans l’obscurité) à 4° C.
    2. Les cultures mères sont utilisées comme sources d’algues pour lancer des cultures «alimentaires» (voir la section suivante). Le volume des cultures mères maintenues à tout moment dépend de la quantité d’algues nécessaire pour l’élevage des daphnies. Il peut rapidement être porté à plusieurs litres, au besoin, à l’aide de bouteilles à sérum de 4 L ou de récipients analogues renfermant chacun 3 L de milieu de croissance.
    3. La température de culture n’est pas critique. Les cultures mères peuvent être maintenues à une température variant entre 20 et 25° C dans des simulateurs d’environnement avec des cultures d’autres organismes si l’éclairement est suffisant (éclairement continu d’environ 4 300 lux, ou 400 piedsbougies, à l’aide d’un fluorescent «blanc froid»).
    4. Les cultures sont mélangées deux fois par jour, à la main.
    5. Les cultures mères peuvent être conservées au réfrigérateur jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour lancer des cultures «alimentaires» ou peuvent être transférées dans un nouveau milieu à raison d’une fois par semaine. On transfère la culture mère d’algues âgée de sept jours, renfermant environ 1,5 × 106 cellules par millilitre, à raison de 1 à 3 mL par volume de 100 mL de milieu de culture frais. L’inoculum doit assurer une densité cellulaire initiale de l’ordre de 10 000 à 30 000 cellules par millilitre dans les nouvelles cultures mères; il faut prendre soin d’éviter la contamination par d’autres microorganismes.
    6. On doit examiner les cultures mères chaque semaine au microscope, au moment du transfert, afin de repérer les cas de contamination microbienne. Les quantités en réserve d’organismes de culture peuvent être conservées pour une durée de 6 à 12 mois si elles sont gardées dans l’obscurité à 4° C. Il est recommandé de préparer, tous les quatre à six mois, de nouvelles cultures mères à partir de cultures «de lancement» obtenues auprès de sources extérieures reconnues.
  3. Création et maintien de cultures «alimentaires» d’algues
    1. Les cultures «alimentaires» sont mises en route sept jours avant d’être utilisées dans les élevages de daphnies. On ajoute environ 20 mL d’une culture mère d’algues âgée de sept jours (décrite au paragraphe précédent), renfermant 1,5 × 106 cellules par millilitre, à chaque litre de milieu de culture d’algues frais (soit 3 L de milieu dans une bouteille de 20 L). L’inoculum doit assurer une densité cellulaire initiale de l’ordre de 30 000 cellules par millilitre. Des techniques aseptiques devraient être utilisées pour la préparation et le maintien des cultures; il faut prendre soin d’éviter la contamination par d’autres microorganismes.
    2. Les cultures alimentaires peuvent être conservées à une température de 20 à 25° C dans des simulateurs d’environnement avec les cultures mères d’algues ou des cultures d’autres organismes si l’éclairement est suffisant (éclairement continu d’environ 4 300 lux à l’aide d’un fluorescent «blanc froid»).
    3. Les cultures sont mélangées en continu sur une plaque d’agitation magnétique (avec une barre d’agitation de taille moyenne) ou dans un appareil à décantation modérément aéré; on peut également les mélanger deux fois par jour à la main. Il faut prendre soin d’éviter que la température des cultures n’augmente de plus de 2 à 3° CNote de bas de page du tableau 31.
  4. Préparation d’un concentré d’algues pour l’alimentation des daphnies
    1. On prépare un concentré d’algues renferment de 3,0 à 3,5 × 107 cellules par millilitre à partir des cultures alimentaires en centrifugeant les algues avec une centrifugeuse à plancton ou à godets ou en laissant les cultures décanter dans un réfrigérateur pendant deux à trois semaines environ et en siphonnant le surnageant.
    2. La densité cellulaire (cellules par millilitre) du concentré se mesure à l’aide d’un compte-particules électronique, d’un microscope et d’un hémacymètre, d’un fluoromètre ou d’un spectrophotomètre. On s’en sert pour établir la dilution (ou la concentration supplémentaire) nécessaire pour atteindre une densité cellulaire définitive de 3,0 à 3,5 × 107cellules par millilitre.
    3. En supposant une densité cellulaire d’environ 1,5 × 106 cellules par millilitre dans les cultures alimentaires d’algues de sept jours et une récupération à 100 % au cours du processus de concentration, une culture de 3 L de sept à dix jours assurer a une densité cellulaire de 4,5 × 109. Ce nombre de cellules fournira environ 150 mL de concentré cellulaire d’algues pour l’alimentation des élevages de daphnies (section 2.4.10).
    4. Le concentré d’algues peut être conservé au réfrigérateur pendant un mois.
Tableau C1 Solutions nutritives mères pour le maintien de cultures mères d’algues
Solution nutritive mère Composé Quantité dissoute dans 500 mL d’eau désionisée
1 Mg Cl2 • 6H2O 6,08 g
1 C aCl2 • 2H2O 2,20 g
1 H3BO3 92, 8 mg
1 Mn Cl2 • 4H2O 208,0 mg
1 ZnCl2 1,64 mgNote de bas de page du tableau a.7
1 F eCl3 • 6H2O 79,9 mg
1 Co Cl2 • 6H2O 0,714 mgNote de bas de page du tableau b.6
1 Na2M oO4 • 2H2O 3,63 mgNote de bas de page du tableau c.5
1 Cu Cl2 • 2H2O 0,006 mgNote de bas de page du tableau d.3
1 Na2EDTA • 2H2O 150,0 mg
2 NaNO3 12,75 g
3 Mg SO4 • 7H2O 7,35 g
4 K2HPO4 0,522 g
5 NaHCO3 7,50 g
Tableau C2a Concentration définitive de macronutriments et de micronutriments dans le milieu de culture
Macronutriment Concentration (mg/L) Élément Concentration (mg/L)
NaNO3  25,5  N 4,20
MgCl2 × 6H2O 12,2  Mg 2,90
CaCl2 × 2H2 4,41 Ca 1,20
MgSO4 × 7H2 14,7  S 1,91
K2HPO4 1,04 P 0,186
NaHCO3 15,0 Na 11,0
NaHCO3 - K 0,469
NaHCO3 - C 2,14

 

Tableau C2b Concentration définitive de macronutriments et de micronutriments dans le milieu de culture
Micronutriment Concentration (µg/L) Élément Concentration (µg/L)
H3BO3  185 B 32,5
MnCl2 × 4H2O 416 Mn 115
ZnCl2  3,27  Zn 1,57
CoCl2 × 6H2O 1,43 Co 0,354
CuCl2 × 2H2 0,012 Cu  0,004
Na2MoO4 × 2H2O 7,26 Mo 2,88
FeCl3 × 6H2O 160 Fe 33,1
Na2EDTA × 2H2O 300 - -

Annexe D

Série logarithmique de concentrations convenant aux essais de toxicitéFootnote32

Tableau 5 Colonne (nombre de concentrations comprises entre 100 et 10, ou entre 10 et 1) Tablenote a.8
1 2 3 4 5 6 7
100 100 100 100 100 100 100
32 46 56 63 68 72 75
10 22 32 40 46 52 56
3,2 10 18 25 32 37 42
1,0 4,6 10 16 22 27 32
  2,2 5,6 10 15 19 24
  1,0 3,2 6,3 10 14 18
    1,8 4,0 6,8 10 13
    1,0 2,5 4,6 7,2 10
      1,6 3,2 5,2 7,5
      1,0 2,2 3,7 5,6
        1,5 2,7 4,2
        1,0 1,9 3,2
          1,4 2,4
          1,0 1,8
            1,3
            1,0

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